"МУК 4.1.2862-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений остаточных количеств Гимексазола в семенах и масле рапса методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 31.03.2011)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28.12.2010 N 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 марта 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики от 23.11.2010 N 01.5.04.692.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в семенах рапса массовой концентрации Гимексазола в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг и в масле рапса в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Структурная формула (не приводится).

Название действующего вещества по номенклатуре ICO: Гимексазол.

Название по ИЮПАК: 5-метилизоксазол-3-ол.

Растворимость при 20 °С (г/л): в воде - 58,2 (pH 3), 67,8 (pH 9), в гексане - 12,2, в метаноле - 968, ацетоне - 730, дихлорметане - 602, этилацетате - 437, толуоле - 176, диэтиловом эфире - 300 г/л.

В обычных условиях Гимексазол стабилен в щелочной среде и относительно стабилен в кислой среде. В растениях деградирует до O- и N-гликозидов, в почве превращается в 5-метил-2-(3P)-оксазолон с периодом полураспада 2 - 25 дней.

Область применения: Гимексазол - системный фунгицид, подавляющий возбудителей заболеваний растений, инфекционное начало которых находится в почве и на семенах.

Гигиенические нормативы: ПДК в воде водоемов - 0,002 мг/куб. дм, ПДК в почве - 0,03 мг/кг, в воздухе рабочей зоны - 1,0 мг/куб. м. МДУ в семенах и масле рапса не установлен.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений (табл. 1) для соответствующих диапазонов концентраций.

Метод основан на определении Гимексазола методом газожидкостной хроматографии с термоионным детектором после его экстракции из проб органическим растворителем и очистке экстракта путем перераспределения между водной и органической фазами и дериватизации с помощью диэтилхлортиофосфата. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

Допускается использование другого вспомогательного оборудования, посуды и материалов с техническими характеристиками не ниже указанных.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать правила техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.019 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности (ГОСТ 12.1.004) и иметь средства пожаротушения (ГОСТ 12.4.009). Содержание вредных веществ в воздухе лабораторного помещения не должно превышать норм, установленных ГН 1.2.2701-10 и ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации газового хроматографа, освоивший данный метод и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерения выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха лабораторного помещения (20 +/- 5) °С и относительной влажности воздуха не более 80%;

- выполнение измерения на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Отбор проб для анализа проводят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" от 21.08.1979 N 2051-79, а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Для исследовательских целей допускается получение в лаборатории масла из проб измельченных семян методом экстракции органическим растворителем при температуре не выше 40 °С. Пробы масла хранят в холодильнике при 4 °С в закрытой стеклянной таре не более 30 суток.

Хроматографическую колонку устанавливают в газовый хроматограф и перед анализом кондиционируют при температуре 280 °С до установления нулевой линии.

Перед началом работы проверяют чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 куб. см растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1,0 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

8.3.1. Приготовление 2N раствора соляной кислоты

В мерную колбу объемом 1 куб. дм с 200 - 300 куб. см дистиллированной воды вносят 164 куб. см концентрированной соляной кислоты, перемешивают, доводят до метки дистиллированной водой и снова перемешивают.

8.3.2. Приготовление 0,4%-го раствора диэтилхлортиофосфата

В мерную колбу объемом 100 куб. см помещают 0,4 г диэтилхлортиофосфата, растворяют в 20 - 30 куб. см ацетона, перемешивают и доводят до метки ацетоном.

8.3.3. Приготовление 25%-го раствора углекислого калия

В мерную колбу объемом 100 куб. см вносят 25 г углекислого калия и растворяют в 50 - 70 куб. см дистиллированной воды, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой.

8.3.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Основной раствор Гимексазола с содержанием 1 мг/куб. см готовят растворением в ацетоне 50 мг аналитического стандарта Гимексазола в мерной колбе объемом 50 куб. см. Методом последовательного разбавления готовят раствор в ацетоне с концентрацией 10 мкг/куб. см.

Для построения градуировочного графика 1 куб. см стандартного раствора с концентрацией 10 мкг/куб. см отбирают в мерную пробирку объемом 5 куб. см с притертой пробкой, добавляют 50 куб. мм 25%-го водного раствора углекислого калия, 2 куб. см 0,4%-го раствора диэтилхлортиофосфата в ацетоне, 1 куб. см ацетона. Пробирку плотно закрывают пробкой и выдерживают в течение 30 мин. на водяной бане при 45 °С <*>.

--------------------------------

<*> Внимание: вещество очень летуче - следить за герметичностью посуды.

По окончании дериватизации пробирку охлаждают до комнатной температуры. Из полученного раствора деривата методом последовательного разбавления готовят градуировочные растворы с концентрациями 0,25; 0,1; 0,05 и 0,025 мкг/куб. см.

Для построения градуировочного графика (площадь пика деривата - концентрация Гимексазола в растворе) в хроматограф вводят по 1 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты или площади пиков и строят график зависимости среднего значения высоты (площади) пика от концентрации Гимексазола в градуировочном растворе (мкг/куб. см).

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

Аналитическую пробу измельченных семян рапса массой (10 +/-0,1) г помещают в коническую колбу с притертой пробкой объемом 250 куб. см, добавляют 20 куб. см дистиллированной воды, помещают на 10 мин. в ультразвуковую ванну и затем выдерживают 2 ч при комнатной температуре для набухания семян. После выдержки в колбу добавляют 80 куб. см ацетона и экстрагируют Гимексазол в течение 10 мин. в ультразвуковой ванне. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера с помощью водоструйного насоса через двойной бумажный фильтр "красная лента". Осадок на фильтре возвращают в колбу и экстракцию повторяют 50 куб. см смеси ацетон - вода (80:20, по объему). Объединенный фильтрат переносят в делительную воронку, обмывая колбу 20 куб. см ацетона. Объединенный фильтрат трижды промывают гексаном порциями по 15 - 20 куб. см, воронку встряхивают в течение 2 мин. и после разделения гексановый слой отбрасывают. Водно-ацетоновый экстракт переносят в колбу-концентратор объемом 300 куб. см, добавляют 0,5 куб. см 25%-го водного раствора углекислого калия и удаляют ацетон при температуре не выше 30 °С на роторном испарителе.

Полученный после упаривания водный остаток переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см, обмывая колбу-концентратор двумя порциями воды по 30 куб. см. К объединенному водному остатку добавляют 1 г двууглекислого натрия, 7 г хлористого натрия и промывают дважды порциями 50 куб. см дихлорметана и дважды 50 куб. см диэтилового эфира. Органические слои отбрасывают. Водный остаток подкисляют 2N раствором соляной кислоты до pH 2 - 3 и экстрагируют Гимексазол дважды порциями 50 куб. см диэтилового эфира. Объединенный диэтиловый экстракт пропускают через 50 г безводного сульфата натрия в концентратор объемом 300 куб. см. В концентратор добавляют 1 куб. см раствора полиэтиленгликоля в ацетоне и упаривают при температуре не выше 30 °С до объема 0,5 - 1 куб. см. Остатки диэтилового эфира удаляют при комнатной температуре в токе азота.

Остаток из концентратора переносят в мерную пробирку с притертой пробкой объемом 5 куб. см, обмывая концентратор трижды порциями ацетона по 1 куб. см. В пробирку добавляют 1 куб. см 0,4%-го раствора диэтилхлортиофосфата в ацетоне и 50 куб. мм 25%-го водного раствора углекислого калия.

Пробирку плотно закрывают притертой пробкой и выдерживают смесь при 45 °С в течение 30 мин. на водяной бане, затем охлаждают при комнатной температуре. В хроматограф вводят 1 куб. мм полученного раствора.

Аналитическую пробу масла рапса массой (10 +/- 0,1) г помещают в плоскодонную колбу с притертой пробкой объемом 100 куб. см, добавляют 50 куб. см смеси гексан:ацетон (2:1) и экстрагируют Гимексазол в течение 10 мин. в ультразвуковой ванне. Экстракт переносят в делительную воронку на 250 куб. см и добавляют 20 куб. см дистиллированной воды. После встряхивания и разделения слоев водно-ацетоновый слой собирают, а в воронку последовательно добавляют 30 куб. см ацетона, встряхивают, а затем 20 куб. см дистиллированной воды. Воронку встряхивают в течение 2 мин. и после разделения водно-ацетоновый слой собирают. Объединенный водно-ацетоновый экстракт переносят в концентратор объемом 100 куб. см, добавляют 0,5 мл 25%-го водного раствора углекислого калия и удаляют ацетон при температуре не выше 30 °С на роторном испарителе.

Полученный после упаривания водный остаток переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см, обмывая колбу-концентратор двумя порциями воды по 30 куб. см. К объединенному водному остатку добавляют 1 г двууглекислого натрия, 7 г хлористого натрия и промывают дважды порциями 50 куб. см дихлорметана и дважды 50 куб. см диэтилового эфира. Органические слои отбрасывают. Водный остаток подкисляют 2N раствором соляной кислоты до pH 2 - 3 и экстрагируют Гимексазол дважды порциями 50 куб. см диэтилового эфира. Объединенный диэтиловый экстракт пропускают через 50 г безводного сульфата натрия в концентратор объемом 300 куб. см. В концентратор добавляют 1 куб. см раствора полиэтиленгликоля в ацетоне и упаривают при температуре не выше 30 °С. Остатки диэтилового эфира удаляют при комнатной температуре в токе азота.

Остаток из концентратора переносят в мерную пробирку с притертой пробкой объемом 5 куб. см, обмывая концентратор трижды порциями ацетона 1 куб. см. В пробирку добавляют 1 куб. см 0,4%-го раствора диэтилхлортиофосфата в ацетоне, 50 куб. мм 25%-го водного раствора углекислого калия.

Пробирку плотно закрывают притертой пробкой и выдерживают смесь при 45 °С в течение 45 мин. на водяной бане, затем охлаждают при комнатной температуре. В хроматограф вводят 1 куб. мм полученного раствора.

Газовый хроматограф "Цвет 550М" с ТИД.

Колонка стеклянная длиной 1 м, диаметром 3 мм, заполненная хроматоном N-super (0,125 - 0,160) с 5% OV-17. Температура колонки 150 °С, испарителя 220 °С, детектора 320 °С.

Расход газа-носителя (азот) - 26,5 куб. см/мин., водорода - 22,4 куб. см/мин., воздуха - 200 куб. см/мин.

Хроматографируемый объем 1 куб. мм.

Время удерживания производного Гимексазола (3,24 +/- 0,05) мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание Гимексазола в пробе (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств Гимексазола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор Гимексазола 0,25 мкг/куб. см, разбавляют ацетоном.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где:

Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,01) <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения Гимексазола в семенах рапса.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Россельхозакадемии, г. Санкт-Петербург.

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 01.5.04.685 от 25.06.2010) и внесена в Федеральный реестр (ФР.1.31.2011.09105).