"Количественный химический анализ биологических объектов. Методика определения содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой"
(утв. Минздравом России 27.06.2003 N ФЦ/3286)

Настоящий документ устанавливает методику количественного химического анализа проб диагностируемых биосубстратов, к которым относят волосы, ногти, кровь, плазму, грудное молочко, мочу, аутопсийные материалы (печень, почки, миокард, плацента), слюну и зубы, для определения в них содержания алюминия, бария, бериллия, ванадия, железа, калия, кадмия, кобальта, лития, магния, марганца, меди, молибдена, никеля, олова, серебра, свинца, стронция, титана, хрома, цинка, циркония (микроэлементы) и натрия, кальция, фосфора (макроэлементы) методом атомной эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой на основе ИСП-АЭС спектрометров фирмы Perkin-Elmer или аналогов.

Методика основана на окислительно-кислотной "мокрой" минерализации проб исследуемых биосубстратов в процессе пробоподготовки и на последующем анализе ее на требуемые химические элементы методом атомно-эмиссионной спектрометрии с использованием в качестве источника возбуждения высокочастотной индуктивно связанной аргоновой плазмы. Метод атомной эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой основан на возбуждении эмиссионных спектров атомов в индуктивно связанной аргоновой плазме и автоматической регистрации положения и интенсивности спектральных линий, соответствующих определяемым элементам.

2.1. Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в таблице 1.

2.2. Значения показателя точности методики используют при:

- оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

- оценке деятельности лабораторий на качество проведения испытаний;

- оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики выполнения измерений в лаборатории.

3.1. Средства измерений и вспомогательное оборудование

3.1.1. Атомно-эмиссионный спектрометр с радиочастотным электромагнитным генератором для возбуждения индуктивно связанной аргоновой плазмы, оборудованный устройством для контроля скоростей потока аргона, компьютером для обработки выходных сигналов спектрометра с возможностью коррекции фоновых сигналов (типа Optima 2000 DV фирмы Perkin-Elmer) для его управления, или подобный, имеющий сертификат Госстандарта России, зарегистрированный в Государственном реестре средств измерений.

3.1.2. Термоблок фирмы Экрос (мод. 4020) или подобный с 30 или более гнездами для фторопластовых пробирок вместимостью 10 куб. см. Возможно использование установок для микроволновой пробоподготовки со фторопластовыми вкладышами в автоклавы.

3.1.3. Аквадистиллятор электрический одноступенчатый или двухступенчатый по ГОСТ 28165.

3.1.4. Мембранная комбинированная установка типа ДВС-М/1НА-1(2)-L для получения деионизованной воды.

3.1.5. Весы аналитические с пределом допускаемой погрешности +/- 0,0005 г, отвечающие требованиям весы лабораторные общего назначения ГОСТ 24104.

3.2. Посуда

3.2.1. Пипетки автоматические, дозаторы любого типа вместимостью 0,2 - 1,0 +/- 1% куб. см.

3.2.2. Стаканы химические термостойкие вместимостью 100 - 150 куб. см по ГОСТ 25336.

3.2.3. Пробирки тефлоновые градуированные на 10 куб. см по ГОСТ 1770-74.

3.2.4. Одноразовые полипропиленовые градуированные центрифужные пробирки без крышек емкостью 15 мл для хранения растворенных образцов.

3.2.5. Одноразовые полипропиленовые градуированные центрифужные пробирки с винтовыми крышками емкостью 50 мл для хранения рабочих стандартов.

3.2.6. Цилиндр мерный вместимостью 100 куб. см по ГОСТ 1770-74.

3.2.7. Стаканчики для взвешивания по ГОСТ 25336.

3.3. Реактивы

3.3.1. Азотная кислота концентрированная по ГОСТ 11125 о.с.ч. или по ГОСТ 4461, дополнительно очищенная методом перегонки в кварцевой посуде с пластиковым (полипропилен) холодильником, сохраняемая в пластиковой фторпластовой посуде.

3.3.2. Аргон газообразный высокой чистоты по ГОСТ 10157.

3.3.3. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72, дополнительно очищенная деионизацией.

3.3.4. Ацетон, о.с.ч., ТУ 2633-039-44493179-00.

3.3.5. Стандартные образцы состава растворов ионов металлов фирмы Перкин-Елмер или отечественные того же состава.

3.4. Материалы

3.4.1. Скальпель хирургический.

3.4.2. Фильтровальная бумага.

3.4.3. Защитная лабораторная пленка фирмы Parafilm(R)"M" или подобная.

4.1. При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами ГОСТ 12.4.019. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

4.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019. Требования безопасности соответствуют рекомендациям, изложенным в техническом описании на приборы.

4.3. Организация обучения работающих безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

4.4. Помещение для проведения измерений должно соответствовать нормативам СНиП ПА-5-700, СН-245-71 и СниП-74, ГОСТ 12.1.004.

4.5. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76.

4.6. При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях", утвержденные МЗ СССР 20.12.82 (М., 1981).

4.7. При работе с баллонами с аргоном необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением", утвержденные Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).

4.6. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4.7. Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В конце рабочего дня после отключения всех приборов проводится влажная уборка рабочих поверхностей.

4.8. Требования безопасности соответствуют правилам и рекомендациям, изложенным в технических описаниях на приборы.

6.1. К выполнению измерений на спектрометре допускаются лица, имеющие опыт работы с оптическими средствами измерений типа атомно-эмиссионного спектрометра с индуктивно связанной плазмой, подтвержденный сертификатом фирмы, выпустившей прибор; изучившие техническое описание измерительного прибора и методику выполнения измерений; обученные в соответствии с ГОСТ 12.0.004-79 и имеющие квалификационную группу не ниже 1 согласно "Правилам технической эксплуатации электроустановок потребителей", утвержденных Госэнергонадзором от 21.12.1984; прошедшие инструктаж по технике безопасности на рабочем месте и ознакомленные с правилами обслуживания спектрометра. К проведению пробоподготовки допускаются операторы с квалификацией лаборант, имеющие опыт работы в химической лаборатории.

7.1. Выполнение измерений проводят при нормальных климатических условиях испытаний с учетом требований руководства (инструкции) по эксплуатации спектрометра: температура воздуха 20 +/- 10 °С; атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.; влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С. Выполнение измерений проводят при нормальных климатических условиях испытаний в соответствии с ГОСТ 15150. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов. При использовании электроприборов частота переменного тока 50 +/- 1 Гц, напряжение сети 220 +/- 10 В. Освещение помещения естественное или искусственное не ограничивается особыми требованиями.

7.2. Подготовка к проведению измерений

Подготовка проб биосубстратов на содержание микроэлементов должна обеспечивать надлежащее хранение проб, правильные процедуры пробоотбора и извлечения микроэлементов из проб, а также подготовку рабочего места для обработки доставленных в лабораторию проб. Все процедуры подготовки проб к анализу должны исключать возможность внесения в них загрязнений. Используемые для пробоподготовки тефлоновые пробирки тщательно промывают последовательно в разбавленной азотной кислоте и дважды ополаскивают деионизованной водой.

8.1. Волосы состригают с затылочной части головы на всю длину в количестве не менее 0,1 г. Для снятия поверхностного загрязнения и обезжиривания волос применяется способ подготовки проб волос, рекомендованный МАГАТЭ. Для этого волосы обрабатываются ацетоном в течение 10 - 15 минут, а затем три раза промываются деионизованной водой. Сушка волос производится при комнатной температуре в течение 10 - 15 минут. Для длительного хранения используют обычные бумажные конверты.

8.2. Для проведения анализа ногтей необходимо срезать ногти с обеих рук. Полученное количество ногтей обрабатывают ацетоном в течение 10 - 15 минут, а затем три раза промывают дистиллированной водой. Сушка ногтей производится при комнатной температуре в течение 10 - 15 минут. Для длительного хранения используют обычные бумажные конверты.

8.3. Кровь может быть получена из локтевой вены (венозная, в условиях стационара) или из пальцев рук (капиллярная). Объем отобранной крови не должен быть менее 1 мл. Образцы крови хранятся в обычном холодильнике до 3 - 5 суток (от 0 до +4 °С), либо замораживаются (до -4 - -18 °С), либо лиофилизуются, или высушиваются в сушильном шкафу (для длительного хранения). Отборы и техники забора таких биосубстратов, как эритроцитарная масса, молоко, спермальная жидкость, слюна, сыворотка крови, лаваж та же.

8.4. Моча может собираться в течение 24 часов или быть средней порцией утренней мочи. Для исследования достаточно 5 мл. При длительном хранении мочу помещают в герметичную посуду (лабораторный пластик или стекло) и хранят в холодильнике до 3-х суток.

8.5. Биоптаты мягких тканей (мышцы, кожа, эпителий, печень и др.) сразу же после забора, препарирования, удаления крови взвешиваются с точностью до 5 мг и помещаются в лабораторную пластиковую или стеклянную посуду, обеспечивающую герметичность хранения. Масса образца ткани от 0,1 г (минимальная, определение макроэлементов - железо, цинк, медь), до 3 - 5 г (определение содержания более 20 химических элементов). Хранение в холодильнике при температуре 0 - +4 °С до 7 суток или в морозильной камере до 20 суток или высушивание и лиофилизация образцов для длительного хранения.

8.6. Пробы конкрементов - зубов, фрагментов костной ткани, особых условий хранения не требуют, помещаются в герметичную упаковку из лабораторного пластика или стекла.

9.1. Волосы, ногти, другие твердые образцы

На аналитических весах берут навеску высушенного, обезжиренного по 8.1, 8.2, 8.6 и измельченного материала массой 0,1 г. Пробу помещают в тефлоновую градуированную пробирку, приливают 2 куб. см о.с.ч. перегнанной азотной кислоты, помещают в термоблок с температурой 115 °С и нагревают до полного растворения пробы. Далее объем охлажденной до комнатной температуры пробы доводят до 10 куб. см дистиллированной деионизованной водой и перемешивают. Пробирку прикрывают приклеивающейся защитной пленкой Parafilm(R)"M", помещают в гнездо автоматического пробоотборника и выполняют измерения на спектрометре.

9.2. Жидкие образцы

Навеску анализируемого объекта 1 - 2 г (~= 1 - 2 куб. см) взвешивают на аналитических весах во фторопластовых пробирках. Каждую пробу помещают в термоблок, разогретый до 115 °С, и упаривают досуха. Далее в каждую пробирку приливают 2 куб. см о.с.ч. перегнанной азотной кислоты и действуют, как описано в п. 9.1.

9.3. При использовании микроволновой пробоподготовки навески образцов помещают в автоклав с фторопластовым вкладышем и приливают 2 куб. см о.с.ч. перегнанной азотной кислоты. Автоклав с пробой во вкладыше помещают в микроволновую печь и проводят разложение пробы в следующем режиме: а) нагрев в печи при мощности 40 Вт в течение 50 с; б) охлаждение - 2 мин.; в) нагрев в печи при мощности 60 Вт в течение 30 с; г) охлаждение - 5 мин. Далее пробу переносят в градуированную пробирку вместимостью 100 мл и доводят объем пробы до 10 куб. см бидистиллированной деионизованной водой, закрывают защитной пластиковой пленкой, перемешивают и направляют на анализ.

9.4. Раствор контрольной пробы готовят с соблюдением всех указанных выше этапов, не отбирая навески пробы биосубстрата.

10.1. Подготовка прибора к работе

Атомно-эмиссионный спектрометр подготавливают к работе в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации. Режимы работы прибора устанавливают в соответствии с рекомендациями фирмы - изготовителя прибора. Рекомендуемый режим проведения измерений приведен в Приложении 1. Для конкретного типа прибора оптимальные режимы могут быть установлены экспериментально. После запуска прибора производят проверку технических характеристик, выполняя положенные по инструкции натриевый тест, тест эквивалентной фоновой концентрации, тест на воспроизводимость, тест на предел обнаружения.

Для измерений используют следующие спектральные линии элементов (нм):

10.2. Устранение мешающих влияний

Поправки на влияние фона при возникновении матричных эффектов и подавление взаимного влияния определяемых элементов вследствие спектральных наложений осуществляют при помощи программного обеспечения спектрометра в соответствии с руководством по эксплуатации спектрометра. Спектральных наложений избегают выбором наилучших аналитических длин волн в эмиссионных спектрах определяемых элементов. Изучение эффекта интерференции и расчет необходимых поправок, учитывающих возможное влияние мешающих элементов, выполняют на стандартных образцах водных азотнокислых растворов элементов со значениями их массовых концентраций, отвечающих их среднему содержанию в биосубстратах. Выбор точек коррекции фона проводят на наиболее типичных пробах биосубстратов и градуировочных растворах смесей элементов измерением интенсивности фонового сигнала с одно- или двухсторонней коррекцией измеряемого спектрального пика элемента.

10.3. Приготовление стандартных градуировочных растворов

Приготавливают три градуировочных раствора. Растворы готовят в соответствии с прилагаемыми к СО инструкциями, разбавляя их 10%-ной о.с.ч. азотной кислотой. 1 куб. см раствора N 1 содержит 0,01 мкг/куб. см Be, 0,1 мкг/куб. см Ва, V, Cd, Co, Li, Mg, Mn, Cu, Mo, Ni, Sn, Ag, Pb, Sr, Ti, Cr, Zn, Zr, 1 мкг/куб. см Al, Fe, K, Na, P. 1 куб. см раствора N 2 содержит 0,1 мкг/куб. см Be, 1 мкг/куб. см Ва, V, Cd, Co, Li, Mg, Mn, Cu, Mo, Ni, Sn, Ag, Pb, Sr, Ti, Cr, Zn, Zr, 5 мкг/куб. см Al, Fe, K, Na, Ca, 10 мкг/куб. см P. 1 куб. см раствора N 3 содержит 10 мкг/куб. см Fe, Mg, Zn, 20 мкг/куб. см К, Na, Ca. Приготовленные 10 - 50 куб. см опорных стандартов сохраняют в полипропиленовых или полистироловых контейнерах. Рабочие стандарты сохраняют и расходуют в течение 1 - 5 рабочих дней. Пример состава рабочих растворов приведен в Приложении 2. В готовый рабочий стандарт добавляют внутренний стандарт - раствор азотнокислого индия с концентрацией ~ 1000 мг In/куб. дм, из расчета 100 мкл на каждые 10 куб. см стандарта.

10.4. Установление градуировочных характеристик

Для получения градуировочной характеристики в режимах, установленных по 10.1, не менее двух раз измеряют на длине волны излучения определяемого элемента интенсивность атомного излучения холостой пробы и приготовленных градуировочных растворов. Определение градуировочной характеристики, обработка и хранение результатов градуировки спектрометра проводят с использованием программного обеспечения спектрометра. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводится через каждые 30 анализируемых проб.

Ввод в ИСП-спектрометр подготовленной пробы и измерение атомного излучения элементов пробы проводят в автоматическом режиме в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации спектрометра. Интенсивность излучения после прохождения света через дифракционную решетку монохроматора и оптическую схему регистрируется фоточувствительным устройством, фототок которого измеряется и обрабатывается компьютерной системой спектрометра.

12.1. Аналитические сигналы ИСП-спектрометра обрабатываются при помощи программного обеспечения спектрометра.

Значения предела повторяемости для двух результатов параллельных определений приведены в таблице 2.

Если условие (2) не выполняется, то в качестве окончательного результата измерения может быть принята медиана результатов трех определений. Кроме того, целесообразно выяснить причины появления неприемлемых результатов параллельных определений.

При выполнении этого условия приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного может быть использовано их общее среднее значение. Значения R приведены в таблице 3.

При превышении предела воспроизводимости могут быть использованы методы оценки приемлемости результатов измерений согласно разделу 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

15.1. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории предусматривает:

- контроль исполнителем процедуры выполнения измерений (на основе оценки погрешности при реализации отдельно взятой контрольной процедуры);

- контроль стабильности результатов измерений (на основе контроля стабильности среднеквадратического отклонения внутрилабораторной прецизионности, погрешности).

15.2. Алгоритм контроля процедуры выполнения измерений с использованием метода добавок

При невыполнении условия (4) эксперимент повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам.

15.3. Периодичность контроля исполнителем процедуры выполнения измерений, а также реализуемые процедуры контроля стабильности результатов выполняемых измерений, регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.