Полное меню
- Актуальное
законодательство - Интернет
и право- - Рассылка ''Закон есть закон''
- - Форум сайта (архив)
- - Законодательство
- - Судебная практика (необычная)
- - Судебная практика (авторская)
- - Процедура UDRP и и решения WIPO
- - Книги серии ''Интернет и Право''
- - Книги в открытом доступе
- - Учебный курс ''Интернет и Право''
- - Учебный курс ''Доменные споры''
- - Литература по ''Интернет и Право''
- - Литература по интел. собственности
- - Научный уголок (работы гостей)
- - Авторские публикации
- Информационные
материалы - ЮРИДИЧЕСКИЕ
УСЛУГИ- - Перечень юридических услуг
- - Карта юридических услуг
- - Юридическая консультация
- - Доменные споры (RU), авторское право
- - Международный суд по доменам (COM)
- - Защита прав на маркетплейсе (WB, Ozon)
- - Защита прав в соцсетях (Vk, Ok, FB)
- - Купля-продажа домена, сайта, ПО
- - Досудебное урегулирование конфликта
- - Защита чести и деловой репутации
- - Отмена блокировки сайта/домена РКН
- - ФАС: товарные знаки, авторское право
- - Регистрация ПО/сайта (Роспатент)
- - Юридическая проверка домена
- - Нотариальное заверение сайтов
- - Способы и формы оплаты услуг
- - Мы в СМИ
- - О компании, клиенты
- - Наши дела и победы
- - Контакты и реквизиты
- Информация
о сайте -
ОписаниеИсточник публикации М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 1999 Примечание к документу Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции" (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки (подтверждения) соответствия продукции (Решение Комиссии Таможенного союза от 09.12.2011 N 880). Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 N 02-03-48/563). Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 N 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 1 января 2000 года. Название документа "МУК 4.1.787-99. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции. Методические указания" (утв. Минздравом России 23.10.1999) "МУК 4.1.787-99. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции. Методические указания"
|
Микотоксин | Время пробопод- готовки, мин. | Степень извлечения, % | Относительное среднее квадратиче- ское отклонение, % |
Афлатоксин В1 | 120 | 75 | 20 |
Зеараленон | 120 | 70 | 20 |
Дезоксиниваленол | 90 | 85 | 10 |
Т-2 токсин | 90 | 85 | 10 |
Для достижения указанной степени извлечения необходимо точно выполнять требования к квалификации органических растворителей, их подготовке и приготовлению растворов, перечисленных в п. 5.1. Алгоритм поиска возможных потерь целевых микотоксинов при подготовке проб приведен в Приложении 1 к настоящим Методическим указаниям.
Патроны Диапак представляют собой пластиковую колонку, содержащую 1 или 3 куб. см герметично упакованного сорбента.
Вскрыть выходную линию патрона Диапак А-3, сняв полимерную заглушку. Установить патрон в вертикальном положении узким концом вниз в подходящее устройство для вакуумирования и сбора элюата. Осторожно открыть полимерную крышку патрона, сформировать ровный горизонтальный верхний слой сорбента легким постукиванием по патрону и зафиксировать его с помощью небольшого ватного тампона. Подключить вакуум к устройству для вакуумирования и обеспечить подачу вакуума к патрону.
Концентрирующий патрон Диапак А-3 одноразового применения и регенерации не подлежит.
Подготовка концентрирующего патрона Диапак АУ-3 проводится аналогично п. 5.3.1.
Концентрирующий патрон Диапак АУ-3 одноразового применения и регенерации не подлежит.
Установить патрон Диапак П-3 вертикально в подходящее устройство для вакуумирования и открыть верхнюю крышку. Суспендировать сорбент при перемешивании стеклянной палочкой в 10 куб. см бензола, дать отстояться сорбенту и пропустить при слабом вакууме, не допуская попадания воздуха на сорбент, последовательно по 10 куб. см бензола и ацетона.
Сохранив слой ацетона около 2 см, ввести пористый полимерный фильтр (имеется в комплекте) и уплотнить его палочкой по верхнему слою сорбента. Затем пропустить оставшийся ацетон и последовательно по 10 куб. см экстрагента и смеси экстрагент - вода (1:1), не допуская попадания воздуха на сорбент со скоростью 2 - 3 капли в секунду.
Сохранив слой последнего элюента около 2 см, отключить вакуум и заглушить патрон сначала верхней крышкой, а затем (после прекращения скапывания) и нижней заглушкой. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение рабочего дня, а при случайном пересыхании приводится в рабочее состояние прокачиванием 10 куб. см смеси экстрагент - вода (1:1).
Концентрирующий патрон Диапак П-3 многоразового применения и подлежит регенерации по схеме, как указано выше, после проведения пробоподготовки.
Снять с патрона Диапак Н заглушки, пропустить через него с помощью шприца 5 куб. см бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25 град. C.
Концентрирующий патрон Диапак Н многоразового применения и подлежит регенерации по следующим схемам после проведения пробоподготовки:
- после подготовки пробы ДТ - последовательно пропустить через патрон по 5 куб. см этилового спирта, ацетона и бензола;
- после подготовки пробы АЗ - последовательно пропустить через патрон по 5 куб. см ацетона и бензола.
Снять с патрона Диапак С заглушки, пропустить через него с помощью шприца 5 куб. см бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25 град. C.
Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.
5.4.1. Зерно и зернопродукты
25 г размолотой пробы перенести в коническую колбу и залить 125 куб. см экстрагента. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. Экстракт отфильтровать через бумажный фильтр "синяя лента".
5.4.2. Орехи и семена масличных культур
25 г размолотой пробы перенести в колбу Эрленмейера, добавить 125 куб. см экстрагента и 40 куб. см гексана. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. После перемешивания внести в экстракт 1 г хлорида натрия и продолжить перемешивание в течение 5 мин. Отфильтровать через бумажный фильтр "синяя лента". Отфильтрованный экстракт перенести в делительную воронку и после расслоения раствора собрать нижний водно - ацетонитрильный слой. Ацетонитрильный экстракт обезжирить 25 куб. см гексана в делительной воронке вместимостью 250 куб. см.
Экстракт перенести в делительную воронку, добавить еще 25 куб. см гептана и интенсивно перемешать. После расслоения собрать нижний водно - ацетонитрильный экстракт.
5.4.3. Масло растительное
25 г масла перенести в колбу Эрленмейера, добавить 40 куб. см гексана и 125 куб. см экстрагента. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. После перемешивания в экстракт внести 0,2 г хлористого натрия и продолжить перемешивание в течение 3 - 5 мин. Экстракт перенести в делительную воронку и после расслоения смеси собрать нижний водно - ацетонитрильный слой. Ацетонитрильный экстракт обезжирить 25 куб. см гексана или гептана или петролейного эфира в делительной воронке вместимостью 250 куб. см.
Экстракт перенести в делительную воронку, добавить еще 25 куб. см гептана и интенсивно перемешать. После расслоения собрать нижний водно - ацетонитрильный экстракт.
5.5.1. Очистка и концентрирование пробы при определении афлатоксина В1 и зеараленона
25 куб. см обезжиренного экстракта пропустить через патрон Диапак А-3 со скоростью 2 - 3 капли в секунду и отобрать 20 куб. см элюата.
Полученный элюат объемом 20 куб. см разбавить равным объемом воды. Полученный раствор пропустить через патрон Диапак П-3 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего патрон промыть 5 куб. см воды и продуть воздухом в течение 1 мин.
Целевую фракцию элюировать с патрона Диапак П-3 последовательно 7 куб. см ацетонитрила и 7 куб. см 33-процентного бензола в ацетонитриле - со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Собранный элюат пропустить через слой безводного сульфата натрия (10 г) самотеком. Колбу ополоснуть 2 куб. см 33-процентного бензола в ацетонитриле и содержимое перенести на тот же слой безводного сульфата натрия. Промыть сульфат натрия 3 куб. см 33-процентного бензола в ацетонитриле. Высушенный фильтрат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 град. C и немедленно перерастворить в 0,5 куб. см бензола.
Бензольный раствор нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак Н. Колбу, содержавшую сухой остаток, обмыть еще 2 раза по 0,5 куб. см бензола и последовательно нанести растворы на патрон Диапак Н. Все смывы с патрона отбросить.
Зеараленон элюировать с патрона Диапак Н 4 куб. см 2-процентной уксусной кислоты в бензоле и упарить досуха (до исчезновения запаха уксусной кислоты) на ротационном испарителе при температуре не выше 50 град. C (Проба З). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.
Затем элюировать афлатоксин В1 5 куб. см 20-процентного ацетонитрила в бензоле с патрона и упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40 град. C (Проба А). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.
Эквивалент массы пробы, взятой на анализ афлатоксина В1, Мпр, - 4 г.
Эквивалент массы пробы, взятой на анализ зеараленона, Мпр, - 4 г.
Рекомендуется для кукурузы и продуктов из нее.
Бензольный раствор нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак С. Колбу, содержавшую сухой остаток, обмыть еще 2 раза по 0,5 куб. см бензола и нанести растворы на патрон Диапак С при достижении верхнего фильтра патрона уровнем предыдущей порции раствора. Все смывы с патрона отбросить.
Зеараленон элюировать с патрона Диапак С 6 куб. см 10-процентного этилацетата в бензоле и упарить досуха (до исчезновения запаха бензола) на ротационном испарителе при температуре не выше 50 град. C (Проба З). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.
Затем через патрон Диапак С последовательно пропустить 3 куб. см 5-процентной уксусной кислоты в бензоле и 4 куб. см 25-процентного гексана в эфире. Все элюаты отбросить. Афлатоксин В1 элюировать с патрона 6 куб. см 10-процентного ацетона в дихлорметане. Элюат упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40 град. C (Проба А). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.
Эквивалент массы пробы, взятой на анализ афлатоксина В1, Мпр, - 4 г.
Эквивалент массы пробы, взятой на анализ зеараленона, Мпр, - 4 г.
дезоксиниваленола и Т-2 токсина
5.5.2.1. Предварительная очистка и концентрирование пробы
20 куб. см экстракта пропустить через патрон Диапак АУ-3 со скоростью 2 - 3 капли в секунду. Элюат собрать. Патрон промыть 5 куб. см экстрагента и отфильтровать объединенные элюаты в сердцевидную колбу, фильтр промыть 2 куб. см ацетонитрила, собирая промывочную жидкость в ту же колбу. Упарить досуха на ротационном испарителе при температуре около 60 - 70 град. C. Упаривание повторить 2 - 3 раза с добавлением в колбу 3 - 5 куб. см пропанола-2 или ацетонитрила до исчезновения капель воды на стенках колбы (Проба ДТ).
5.5.2.2. Окончательная очистка на патроне Диапак Н
Пробу ДТ растворить в 0,5 куб. см хлороформа и нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак Н. Колбу обмыть еще 2 раза по 0,5 куб. см хлороформа и последовательно нанести растворы на тот же патрон, начав сбор фракций, содержащих Т-2 токсин, в отгонную колбу. Завершить элюирование Т-2 токсина 2 куб. см хлороформа в ту же колбу. Элюат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре 40 - 45 град. C и перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению Т-2 токсина (Проба Т).
Дезоксиниваленол элюировать с патрона в другую отгонную колбу 6 куб. см 20-процентного ацетона в хлороформе. Элюат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре 40 - 45 град. C и перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению дезоксиниваленола (Проба Д).
Эквивалент массы пробы, взятой на анализ дезоксиниваленола, Мпр, - 4 г.
Эквивалент массы пробы, взятой на анализ Т-2 токсина, Мпр, - 4 г.
??????????????????????????????????????????????????????????????????
?Испаритель ротационный ИР-1М2 или устройство ?ТУ 25-1173.102-84?
?для упаривания проб в токе азота при нагрева- ?или др. ?
?нии около 40 град. C ? ?
?Центрифуга типа ЦЛН-2 или аналогичная ?ТУ 5-375-4171-73 ?
?Устройство для создания вакуума около -0,7 мм ? ?
?рт.ст. (водоструйный насос, масляный вакуумный? ?
?насос, медицинский отсасыватель) ? ?
?Вакуумное устройство для подготовки проб (ва- ? ?
?куумный манифолд), с приемниками проб вмести- ? ?
?мостью не менее 10 куб. см ? ?
?Концентрирующий патрон Диапак С16М, ?ТУ 4215-002 - ?
?ЗАО "БиоХимМак СТ" ?05451931-94 ?
?Концентрирующий патрон Диапак С, ?ТУ 4215-002 - ?
?ЗАО "БиоХимМак СТ" ?05451931-94 ?
?Пинцет медицинский, 15 см ? ?
?Шприц вместимостью 10 или 20 куб. см типа Луер? ?
?Колбы плоскодонные конические с пробками, ?ГОСТ 25336 ?
?вместимостью 50 куб. см ? ?
?Колбы остродонные с пробками, с взаимозаменяе-?ГОСТ 25336 ?
?мым конусом 14/23 вместимостью 10 или 25 куб. ? ?
?см ? ?
?Колбы грушевидные с пробками, с взаимозаменяе-?ГОСТ 25336 ?
?мым конусом 14/23 вместимостью 25 куб. см ? ?
?Цилиндры мерные вместимостью 50 куб. см, ?ГОСТ 1770 ?
?2 кл., или пробирка градуированная вместимос- ? ?
?тью 15 или 20 куб. см ? ?
?Микрошприц вместимостью 100 куб. мм или пипет-?ГОСТ 20292 ?
?ка с делениями исполнения 4 или 5, 1-го класса? ?
?точности вместимостью 1 куб. см ? ?
?Вата медицинская нестерилизованная, х/б ? ?
?Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ?ТУ 6-09-14 - ?
?ОП-3, осч, ректифицированный или ?2167-84 ?
?Ацетонитрил, 1 сорт, кооператив "Криохром", ? ?
?г. Санкт - Петербург ? ?
?Ацетон, осч, ОП-2, ректифицированный ?ТУ 6-09-3513-75 ?
?Гептан, гексан, хч, или петролейный эфир (мар-?ТУ 6-09-3375-78 ?
?ки 70-100), ректифицированный ? ?
?Кислота лимонная, 1-водная, чда ?ГОСТ 3652-29 ?
ИС NORMPROD: примечание.
Взамен ГОСТ 4233-66 Постановлением Госстандарта СССР
от 08.04.1977 N 882 с 1 января 1978 года введен в действие
?Хлорид натрия, хч ?ГОСТ 4233-66 ?
?Хлороформ медицинский, выдержанный над CaCl ? ?
? 2 ? ?
?ректифицированный ? ?
?Сульфат натрия, безводный, хч ?ГОСТ 4166-76 ?
?Вода дистиллированная ? ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
20% ацетона в хлороформе - к 20 куб. см ацетона добавить хлороформ до 100 куб. см общего объема или 5% метанола в хлороформе - к 20 куб. см хлороформа добавить 5 куб. см метанола, объем раствора довести хлороформом до 100 куб. см.
Афлатоксин М1 извлекают из пробы жидкого молока пропусканием ее через патрон Диапак С16М. Затем фракцию, содержащую афлатоксин М1, элюируют хлороформом с патрона и, после высушивания и упаривания, проводят окончательную очистку на патроне Диапак С. Подготовленная проба готова к хроматографическому анализу.
Афлатоксин М1 из кисломолочных напитков и сметаны экстрагируют хлороформом в присутствии хлорида натрия и лимонной кислоты в соответствии с МУ N 4082-86 <*> и, после высушивания и упаривания, проводят окончательную очистку на патроне Диапак С.
--------------------------------
<*> Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Утв. МЗ СССР 20.03.86 N 4082-86.
Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения микотоксинов проводят анализ методом стандартной добавки в исходный экстракт.
Время проведения пробоподготовки - 60 мин. Степень извлечения <*> - 80%. Относительное среднее квадратическое отклонение - 10%.
--------------------------------
<*> При снижении степени извлечения афлатоксина М1 см. Приложение 1.
Снять с патрона Диапак С16М заглушки и пропустить через него с помощью шприца последовательно по 5 куб. см ацетонитрила и воды. Заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25 град. C.
Концентрирующий патрон Диапак С16М одноразового применения и регенерации не подлежит.
Снять с патрона Диапак С заглушки и пропустить через него с помощью шприца 5 куб. см бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25 град. C.
Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.
проб молока
Пробу молока 50 куб. см центрифугировать на подходящем оборудовании в течение 5 мин. при 1000 об./мин. Для определения афлатоксина М1 отобрать 20 куб. см супернатанта, избегая попадания жира.
Сухое молоко растворяется в соответствии с инструкцией или соответствующим ТУ и обрабатывается, как описано выше.
20 куб. см подогретой до 40 град. C подготовленной пробы молока пропустить через предварительно подготовленный патрон Диапак С16М со скоростью 3 капли в секунду. Затем патрон промыть 5 куб. см дистиллированной воды и высушить продуванием воздуха в течение 1 мин. Элюаты отбросить. Патрон промыть 10 куб. см гексана и вновь высушить воздухом в течение 1 мин.
Афлатоксин М1 элюировать 6 куб. см хлороформа. Собранный элюат пропустить самотеком через слой безводного сульфата натрия (3 куб. см). Колбу обмыть 1 куб. см хлороформа, и содержимое перенести на тот же слой безводного сульфата натрия. Хлороформные растворы собрать (Экстракт М).
6.4.2. Подготовка проб сметаны и кисломолочных
продуктов
В коническую колбу вместимостью 250 куб. см помещают навеску
20,0 г сметаны или 40 куб. см кисломолочного напитка. Затем туда
же вносят 10,0 куб. см водного раствора 2 г хлорида натрия и 0,24
г лимонной кислоты и 100 куб. см хлороформа (все составные части
предварительно подогревают до температуры 35 - 38 град. C).
Содержимое колбы встряхивают 2 - 3 мин., переносят в центрифужные
стаканы и центрифугируют 15 мин. при 3000 - 4000 об./мин. Отделяют
нижний хлороформный слой, высушивают над 10 г безводного сульфата
натрия, отфильтровывают, измеряют объем фильтрата (V ) и упаривают
ф
до 5 - 6 куб. см (Экстракт М).
Экстракт М нанести на патрон Диапак С со скоростью 3 - 4 капли в секунду. Промыть сульфат натрия 1 куб. см хлороформа, и раствор нанести на патрон Диапак С при достижении верхнего фильтра патрона уровнем предыдущей порции раствора.
Афлатоксин М1 элюировать с патрона 10 куб. см 20-процентного ацетона в хлороформе или 7 куб. см 5-процентного метанола в хлороформе. Элюат собрать и упарить досуха на ротационном испарителе или в слабом токе азота при температуре не выше 40 град. C. Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению (Проба М).
Эквивалент массы пробы молока, взятой на анализ афлатоксина
М1, М , - 20 г.
пр
Эквивалент массы пробы сухого молока рассчитывается по
формуле:
m
М = --- x 20, (6.1)
пр V
где:
М - эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;
пр
m - масса пробы сухого молока, г;
V - объем воды для растворения пробы сухого молока, куб. см.
Эквивалент массы пробы сметаны или кисломолочных напитков,
взятой на анализ, рассчитывается по формуле:
V
ф
M = --- x m , (6.2)
пр 100 пр
где:
M - эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;
пр
V - объем фильтрата, куб. см;
ф
m - масса (объем) пробы сметаны или кисломолочных напитков,
пр
г (куб. см).
??????????????????????????????????????????????????????????????????
?Испаритель ротационный ИР-1М2 ?ТУ 25-1173.102 - ?
? ?84 или др. ?
?Центрифуга типа ЦЛН-2 или аналогичная ?ТУ 5-375-4171-73 ?
?Устройство для создания вакуума около -0,7 мм ? ?
?рт.ст. (водоструйный насос, масляный вакуумный? ?
?насос, медицинский отсасыватель) ? ?
?Вакуумное устройство для подготовки проб (ва- ? ?
?куумный манифолд), с приемниками проб вмести- ? ?
?мостью не менее 10 куб. см ? ?
?Устройство для упаривания проб в токе азота ? ?
?при нагревании около 40 град. C (желательно ? ?
?суховоздушная баня) ? ?
?Концентрирующий патрон Диапак П-3, ?ТУ 4215-002 - ?
?ЗАО "БиоХимМак СТ" ?05451931-94 ?
?Концентрирующий патрон Диапак С, ?ТУ 4215-002 - ?
?ЗАО "БиоХимМак СТ" ?05451931-94 ?
?Пинцет медицинский, 15 см ? ?
?Колбы плоскодонные конические с пробками вмес-?ГОСТ 25336 ?
?тимостью 50 куб. см ? ?
?Колбы остродонные с пробками с взаимозаменяе- ?ГОСТ 25336 ?
?мым конусом 14/23 вместимостью 5, 10 или 25 ? ?
?куб. см ? ?
?Колбы грушевидные с пробками с взаимозаменяе- ?ГОСТ 25336 ?
?мым конусом 14/23 вместимостью 25 куб. см ? ?
?Пробирка градуированная вместимостью 15 или 20?ГОСТ 1770 ?
?куб. см ? ?
?Цилиндры мерные вместимостью 10 и 50 куб. см, ?ГОСТ 1770 ?
?2 кл. ? ?
?Микрошприц вместимостью 100 куб. мм (или пи- ?ГОСТ 20292 ?
?петка с делениями исполнения 4 или 5, 1-го ? ?
?класса точности вместимостью 1 куб. см) ? ?
?Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ ? ?
?Вата медицинская нестерилизованная, х/б ? ?
?Ацетат цинка 2-водный, чда ?ГОСТ 5823 ?
?Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ?ТУ 6-09-14 - ?
?ОП-3 осч, ректифицированный ?2167-84 ?
?Ацетон, осч, ректифицированный, ОП-2 ?ТУ 6-09-3513-75 ?
?Бензол, хч, ректифицированный ?ГОСТ 5955-75 ?
?Гексацианоферрат II калия (калий железистоси- ?ГОСТ 4207 ?
?неродистый) 3-водный, хч ? ?
?Гептан, гексан, хч или петролейный эфир ?ТУ 6-09-3375-78 ?
?(фракция 70-100), хч, ректифицированный ? ?
?Хлороформ, медицинский, выдержанный над CaCl ,? ?
? 2 ? ?
?ректифицированный ? ?
?Этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты), ?ГОСТ 22300-76 ?
?хч, выдержанный над Na CO и ректифицированный? ?
? 2 3 ? ?
?Карбонат натрия, хч ?ГОСТ 83-79 ?
?Сульфат натрия, безводный, хч ?ГОСТ 4166-76 ?
?Вода бидистиллированная ? ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
1,5% карбоната натрия - 1,5 г карбоната натрия растворить в 100 куб. см воды.
15% этилацетата в бензоле - 15 куб. см этилацетата разбавить бензолом до 100 куб. см.
30% этилацетата в бензоле - 30 куб. см этилацетата разбавить бензолом до 100 куб. см.
Раствор Карреза I - 15,0 г гексацианоферрата II калия растворить в 100 куб. см воды.
Раствор Карреза II - 30,0 г ацетата цинка растворить в 100 куб. см воды.
Микотоксин патулин извлекают из проб осветленных соков и
напитков пропусканием их через патрон Диапак П-3. Затем патулин
элюируют этилацетатом с патрона и после обработки раствором
Na CO , высушивания, упаривания и перерастворения проводят
2 3
окончательную очистку на патроне Диапак С.
Соки и напитки с мякотью и консистентные продукты разводят
водой, осветляют растворами Карреза в соответствии с ГОСТом
28038-89 <*>, фильтруют и экстрагируют патулин пропусканием
фильтрата через патрон Диапак П-3. Затем патулин элюируют
этилацетатом с патрона и после обработки раствором Na CO ,
2 3
высушивания, упаривания и перерастворения проводят окончательную
очистку на патроне Диапак С.
--------------------------------
<*> Продукты переработки плодов и овощей. Метод определения
микотоксина патулина. ГОСТ 28038-89.
Подготовленные пробы готовы к хроматографическому анализу.
Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения патулина проводят анализ методом стандартной добавки в пробу.
Время проведения пробоподготовки - 90 мин. Степень извлечения <*> - 60%. Относительное среднее квадратическое отклонение - 10%.
--------------------------------
<*> При снижении степени извлечения патулина см. Приложение 1.
Установить патрон Диапак П-3 вертикально в подходящее устройство для вакуумирования и открыть верхнюю крышку. Суспендировать сорбент при перемешивании стеклянной палочкой в 10 куб. см бензола, дать отстояться сорбенту и пропустить при слабом вакууме, не допуская попадания воздуха, последовательно по 10 куб. см бензола и ацетона.
Сохранив слой ацетона около 2 см, ввести пористый полимерный фильтр (имеется в комплекте) и уплотнить его палочкой по верхнему слою сорбента. Затем пропустить оставшийся ацетон и последовательно по 10 куб. см экстрагента (см. п. 5.1) и смеси экстрагент - вода (1:1), не допуская попадания воздуха на сорбент со скоростью 2 - 3 капли в секунду.
Сохранив слой последнего элюента около 2 см, отключить вакуум и заглушить патрон сначала верхней крышкой, а затем (после прекращения скапывания) и нижней заглушкой. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение рабочего дня, а при случайном пересыхании приводится в рабочее состояние прокачиванием 10 куб. см смеси экстрагент - вода (1:1).
Перед проведением пробоподготовки через патрон Диапак П-3 пропустить 10 куб. см воды.
Концентрирующий патрон Диапак П-3 многоразового применения и подлежит регенерации после проведения пробоподготовки по схеме его подготовки, как указано выше.
Снять с патрона Диапак С заглушки и пропустить через него с помощью шприца 5 куб. см бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25 град. C.
Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.
7.4.1. Подготовка осветленных соков и напитков
Отфильтровать пробу через плотный бумажный фильтр до получения 20 куб. см фильтрата (Фильтрат П).
7.4.2. Подготовка соков и напитков с мякотью
и консистентных продуктов
Навеску пробы массой 10,0 г поместить в стеклянный стакан, смешать с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 куб. см. В мерную колбу внести 6,0 куб. см раствора Карреза I и 6,0 куб. см раствора Карреза II. Содержание колбы довести дистиллированной водой до метки, тщательно перемешать и отфильтровать в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Измерить объем фильтрата (Фильтрат П).
Весь объем Фильтрата П нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак П-3 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Промыть патрон 5 куб. см бидистиллированной воды. Все смывы отбросить.
Патулин элюировать с патрона 10 куб. см этилацетата в колбу или мерную пробирку с пришлифованной пробкой, содержащую 5 куб. см 1,5-процентного карбоната натрия, закрыть пробкой, интенсивно перемешать и дать отстояться. Декантировать верхний этилацетатный слой, высушить его безводным сульфатом натрия (3 г) и перенести в колбу для упаривания. В колбу или пробирку, содержащую оставшийся 1,5-процентный карбонат натрия, добавить еще 10 куб. см этилацетата, перемешать и, после полного расслоения, высушивания этилацетатного слоя тем же сульфатом натрия, объединить его с первой порцией этилацетатного раствора в той же колбе для упаривания. Операцию повторить с 5 куб. см этилацетата.
Упарить этилацетатный раствор на ротационном испарителе при температуре не выше 40 град. C до объема около 0,5 куб. см (не упаривать досуха!). Количественно перенести пробу в сердцевидную колбу вместимостью не более 5 куб. см или в полимерную пробирку типа Эппендорф, промыв предыдущую отгонную колбу 0,5 куб. см этилацетата, и присоединить к упариваемой пробе. Пробу упарить в токе азота при температуре не более 40 град. C в суховоздушной бане до 0,5 куб. см и добавить к ней 2,5 куб. см бензола.
Бензол - этилацетатный раствор пропустить через патрон Диапак C со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Обмыть колбу еще 0,5 - 1,0 куб. см 15-процентного этилацетата в бензоле и нанести на патрон. Все смывы отбросить.
Патулин элюировать с патрона 6 куб. см 30-процентного этилацетата а бензоле, собирая элюат в сердцевидную отгонную колбу. Элюат упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40 град. C в суховоздушной бане.
Внимание! После упаривания пробу немедленно перерастворить в 100 мкл хлороформа, охлажденного до 0 - 5 град. C (для ТСХ - анализа) или в 100 - 500 мкл охлажденной до 5 - 8 град. C бидистиллированной воды, подкисленной до pH 4,0 уксусной кислотой (для ВЭЖХ - анализа) и быстро охладить до 0 - 5 град. C (Проба П). Хранить Пробу П в холодильнике не более 1 ч.
Эквивалент массы пробы осветленных соков и напитков, взятой на
анализ, М , - 20 г, соков и напитков с мякотью и консистентных
пр
продуктов определяется по формуле:
V
Фр.П
М = ----- x m , (7.1)
пр 50 пр
где:
М - эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;
пр
V - объем Фракции П, куб. см;
Фр.П
m - масса пробы соков и напитков с мякотью или консистентных
пр
продуктов, г.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ МЕТОДИКА
ИСПЫТАНИЙ КОНЦЕНТРИРУЮЩИХ ПАТРОНОВ ДИАПАК
Каждая партия концентрирующих патронов Диапак П-3, Диапак С16М, Диапак Н, Диапак С, а также партии сорбентов Диасорб А и Диасорб АУ подвергаются выходному контролю в соответствии с ТУ 4215-002-05451931-94 на их соответствие требованиям, предъявляемым к специализированным патронам для твердофазной экстракции микотоксинов. Этим метрологически обеспечивается их производство.
Применение настоящих испытаний рекомендуется проводить в следующих случаях:
- если результат проверки правильности проведения пробоподготовки методом стандартной добавки не соответствует нормативу коэффициента извлечения;
- если патроны Диапак подвергались неправильному хранению или нарушена целостность упаковки;
- в случаях дополнительного сверхнормативного использования регенерируемых патронов (Диапак Н, Диапак П-3).
Приведенные ниже методики проверки патронов Диапак позволяют выявить ошибку по стадиям пробоподготовки. При соответствии характеристик патронов Диапак нормативным требованиям следует искать ошибки в правильности подготовки растворителей и приготовлении растворов, контроле условий упаривания и перерастворения анализируемых проб.
Если среди стадий подготовки пробы присутствует подготовка на патроне Диапак С, рекомендуется начинать анализ возможной потери целевого компонента именно с этого патрона. Это связано с чувствительностью силикагеля к качеству используемых растворителей, и прежде всего с содержанием в них воды. Такая специфика сильной зависимости активности патрона Диапак С от условий его хранения и качества используемых растворителей может потребовать оптимизации количества элюента, используемого при работе с этими патронами в конкретной лаборатории.
Настоящая Методика предназначена для метрологического
обеспечения применения патронов Диапак в анализе микотоксинов и
устанавливает процедуру их испытаний. Критерием качества патронов
Диапак является соответствие результатов испытаний нормативам
коэффициента извлечения, K , в модельных экспериментах в
R
соответствии со схемами элюирования, приведенными в разделах 5 - 7
настоящих Методических указаний.
Коэффициент извлечения рассчитывают по формуле:
C' x K
d
K = ------- x 100, (1)
R C
гр
где:
K - коэффициент извлечения данных микотоксинов, %;
R
C' - концентрация данного микотоксина, найденная в результате
испытания, мкг/куб. см (или S' площадь хроматографического пика,
соответствующая концентрации C');
C - концентрация того же микотоксина, используемая для
гр
градуировки хроматографической системы, мкг/см (или S площадь
гр
хроматографического пика, соответствующая концентрации C );
гр
K - коэффициент разведения образца.
d
За окончательное значение K принимается среднее
R
арифметическое результатов двух параллельных испытаний, если
абсолютное расхождение между ними не превышает 5%.
Испытания проводятся относительным методом по схеме "введено - найдено", поэтому специальных требований к стандартным образцам микотоксинов не предъявляется.
Диапак П-3 по афлатоксину В1 и зеараленону
Испытание патронов Диапак А-3 проводится совместно с Диапак П-3 из-за низких концентраций афлатоксина В1 и зеараленона, а также их температурной лабильности, приводящей к невозможности концентрирования упариванием. Патрон Диапак П-3 может быть испытан независимо от Диапак А-3, что рекомендуется выполнять потребителю через каждые 10 проб после соответствующей регенерации по п. 5.3.3.
Приготовить из имеющихся стандартных растворов микотоксинов
1,0 куб. см испытательной смеси, содержащей 0,4 мкг афлатоксина В1
и 4,0 мкг зеараленона в произвольной смеси бензола и ацетонитрила.
Аликвоту смеси объемом 0,25 куб. см перенести в сердцевидную
колбу, и упарить растворители досуха в токе азота при температуре
40 град. C. Немедленно перерастворить остаток в 0,25 куб. см
растворителя, соответствующего конечному хроматографическому
определению. Ориентировочные значения концентраций: 0,4 мкг/куб.
см - для афлатоксина В1 и 4,0 мкг/куб. см - для зеараленона.
Ввести раствор не менее двух раз в хроматографическую систему и
рассчитать среднее арифметическое значение площадей пиков каждого
из микотоксинов, C (S ).
гр гр
Подготовить патроны Диапак А-3 и Диапак П-3 в соответствии с
Вторую аликвоту смеси объемом 0,25 куб. см упарить аналогично,
перерастворить в 25 мл экстрагента (смеси ацетонитрил - вода -
84:16) и нанести на патрон Диапак А-3 в соответствии с п. 5.1.1.
Полученные 20 мл элюата сконцентрировать на патроне Диапак П-3 в
соответствии с п. 5.1.1. Концентрат перерастворить и
проанализировать аналогично градуировочному эксперименту, получив
значение C'(S').
Рассчитать значение K по формуле (1). Значение K = 1,25.
R d
Коэффициент извлечения, K , должен быть не менее 90% - для
R
афлатоксина В1 и 85% - для зеараленона.
При испытании одного патрона Диапак П-3 вторую аликвоту
объемом 0,25 куб. см после упаривания перерастворить в 40 мл смеси
экстрагент - вода (1:1) (смеси ацетонитрил - вода 42:58) и
сконцентрировать в соответствии с п. 5.1.1. Рассчитать значение
K , принимая K = 1,00. Коэффициент извлечения, K , должен быть не
R d R
менее 95% - для афлатоксина В1 и 95% - зеараленона.
по дезоксиниваленолу и Т-2 токсину
Приготовить из имеющихся стандартных растворов микотоксинов
1,0 см испытательной смеси, содержащей по 20 мкг дезоксиниваленола
и Т-2 токсина в произвольной смеси бензола и ацетонитрила.
Аликвоту смеси объемом 0,25 куб. см перенести в сердцевидную
отгонную колбу и упарить досуха на ротационном испарителе при
температуре 40 - 50 град. C. Перерастворить остаток в 0,25 куб. см
растворителя, соответствующего конечному хроматографическому
определению. Ориентировочное значение концентраций: 20 мкг/куб. см
- для дезоксиниваленола и Т-2 токсина. Для градуировки
хроматографической системы ввести раствор не менее двух раз и
рассчитать среднее арифметическое значение площадей пиков каждого
из микотоксинов, C (S ).
гр гр
Подготовить патрон Диапак АУ-3 по п. 5.3.2.
Вторую аликвоту смеси объемом 0,25 куб. см упарить аналогично,
перерастворить в 20 мл экстрагента (смеси ацетонитрил - вода
84:16) и нанести на патрон Диапак АУ-3, в соответствии с п. 5.5.2.
После упаривания досуха остаток перерастворить и проанализировать
аналогично градуировочному эксперименту, получив значение C' (S').
Рассчитать значение K по формуле 1. Значение K = 1,00.
R d
Коэффициент извлечения K должен быть не менее 95% - для
R
дезоксиниваленола и Т-2 токсина.
Концентрирующие патроны Диапак Н являются универсальными
регенерируемыми патронами для окончательной очистки афлатоксина
В1), зеараленона, дезоксиниваленола и Т-2 токсина, поэтому
испытание рекомендуется выполнять через каждые 10 проб после
очередной регенерации по п. 5.3.4. Патроны Диапак Н обеспечивают
тонкую очистку указанных микотоксинов с высокими метрологическими
характеристиками (K не менее 90%), поэтому значения K менее 90%
R R
чаще всего свидетельствуют об ошибках в приготовлении элюентов или
о недостаточной чистоте растворителей.
3.1. Испытание по афлатоксину В1 и зеараленону
Сухой остаток упаренной второй аликвоты испытательной смеси по
п. 1 немедленно перерастворить в 0,5 мл бензола и нанести по
Н. После элюирования и упаривания Пробы З и Пробы А немедленно
перерастворить их в 0,25 куб. см растворителя, соответствующего
конечному хроматографическому определению, и проанализировать
аналогично градуировочному эксперименту по п. 1, получив значение
C (S ) и C'(S') по каждому из микотоксинов.
гр гр
Рассчитать значение K по формуле (1). Значение K = 1,00.
R d
Коэффициент извлечения K должен быть не менее 90% - для
R
афлатоксина В1 и зеараленона.
3.2. Испытания по дезоксиниваленолу и Т-2 токсину
Сухой остаток упаренной второй аликвоты испытательной смеси по
п. 2 перерастворить в 0,5 мл хлороформа и нанести по условиям п.
5.1.2 на подготовленный патрон Диапак Н. После элюирования и
упаривания Пробу Д и Пробу Т перерастворить в 0,25 куб. см
растворителя, соответствующего конечному хроматографическому
определению, и проанализировать аналогично градуировочному
эксперименту по п. 2, получив значения C (S ) и C'(S') по
гр гр
каждому из микотоксинов.
Рассчитать значения K по формуле (1). Значение K = 1,00.
R d
Коэффициент извлечения K должен быть не менее 90% для
R
дезоксиниваленола и Т-2 токсина.
Концентрирующие патроны Диапак С являются одноразовыми
патронами для окончательной очистки афлатоксина В1 и зеараленона,
а также афлатоксина М1 и патулина. Патроны Диапак С обеспечивают
тонкую очистку указанных микотоксинов с хорошими метрологическими
характеристиками (K = 75 - 90%). Для достижения указанных
R
характеристик необходимо установить оптимальный объем элюирования
моделированием порционного элюирования (1 - 3 порции по 3 мл)
целевых фракций в ходе настоящих испытаний.
Оптимальную схему элюирования, т.е. необходимое число порций по 3 мл, потребитель устанавливает по достижению суммарного коэффициента извлечения не ниже указанного норматива. Установленный объем элюирования подлежит проверке при смене партии растворителей и их смесей, используемых для тонкой очистки микотоксинов.
Подготовить патрон Диапак С в соответствии с п. 5.3.5.
Сухой остаток упаренной второй аликвоты испытательной смеси по
п. 1 немедленно перерастворить в 0,5 мл бензола и нанести на
патрон Диапак С в соответствии с п. 5.1.3. После элюирования и
раздельного упаривания трех фракций Пробы З и трех фракций Пробы А
немедленно перерастворить их в 0,25 куб. см растворителя,
соответствующего конечному хроматографическому определению, и
проанализировать аналогично градуировочному эксперименту по п. 1,
получив по три значения S и одному S' по каждому из
гр
микотоксинов.
Рассчитать K по формуле (1) для каждой из трех фракций Проб З
R
и А K = 1,00. Суммарный коэффициент извлечения K должен быть не
d R
менее 90% - для афлатоксина В1 и 85% - для зеараленона. Определить
минимально возможное число последовательных фракций,
обеспечивающее суммарный K не ниже норматива. Найденное число
R
фракций (от 1 до 3) и определяет оптимальный объем элюирования
данных микотоксинов с патрона Диапак С данной партии с
приготовленными растворителями.
Если значение суммарного K меньше нормативного значения, то
R
это свидетельствует об ошибках в приготовлении элюирующих смесей
и/или о недостаточной чистоте растворителей, в особенности с точки
зрения содержания в них воды.
Приготовить из имеющегося стандартного раствора 1,0 куб. см
испытательной смеси, содержащей 0,1 мкг афлатоксина М1 в
произвольной смеси бензола и ацетонитрила. Аликвоту смеси объемом
0,25 куб. см перенести в сердцевидную колбу и упарить раствор в
токе азота при температуре 40 град. C. Немедленно перерастворить
остаток в 0,25 - 1,0 куб. см растворителя, соответствующего
конечному хроматографическому определению. Ориентировочные
значения концентраций афлатоксина М1 0,025 - 0,1 мкг/куб. см
соответственно. Для проведения градуировочного эксперимента ввести
раствор не менее двух раз в хроматографическую систему и
рассчитать среднее арифметическое значение площадей пиков
афлатоксина М1, C (S ).
гр гр
Вторую аликвоту смеси объемом 0,25 куб. см упарить, как описано выше, перерастворить в 6 мл хлороформа и нанести в условиях п. 6.5 на подготовленный (см. п. 6.3.2) патрон Диапак С. После элюирования и раздельного упаривания трех последовательных фракций Пробы М немедленно перерастворить их в 0,25 - 1,0 куб. см растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению, и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту, получив три значения C'(S') по афлатоксину М1.
Рассчитать K по формуле (1) для каждой их трех фракций Пробы
R
М K = 1,00. Суммарный коэффициент извлечения K для афлатоксина
d R
М1 должен быть не менее 85%. Найти оптимальный объем элюирования
афлатоксина М1 с патрона Диапак С по алгоритму, приведенному в п.
4.1. Там же приведен алгоритм поиска ошибок.
Приготовить из имеющегося стандартного раствора 1,0 куб. см
испытательной смеси, содержащей 4,0 мкг патулина в произвольной
смеси бензола и ацетонитрила. Аликвоту смеси объемом 0,25 куб. см
перенести в сердцевидную колбу и упарить растворитель в токе азота
при температуре 35 - 40 град. C. Немедленно перерастворить остаток
в 0,25 куб. см растворителя, соответствующего конечному
хроматографическому определению. Ориентировочное значение
концентрации патулина: 4,0 мкг/куб. см. Для проведения
градуировочного эксперимента ввести раствор не менее двух раз в
хроматографическую систему и рассчитать среднее арифметическое
значение площади пика патулина, C (S ).
гр гр
Вторую аликвоту смеси объемом 0,25 куб. см упарить аналогично, перерастворить в 3 мл 15-процентного этилацетата в бензоле и нанести в условиях п. 7.5.2 на подготовленный (см. п. 7.3.2) патрон Диапак С. После элюирования и раздельного упаривания трех последовательных фракций Пробы П немедленно перерастворить их в 0,25 куб. см растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению, и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту по п. 4.3, получив три значения C'(S') по патулину.
Рассчитать значение K по формуле (1) для каждой из трех
R
фракций Пробы П. K = 1,00. Суммарный коэффициент извлечения K
d R
для патулина должен быть не менее 75%. Найти оптимальный объем
элюирования патулина с патрона Диапак С по алгоритму, приведенному
в п. 4.1. Там же приведен алгоритм поиска ошибок.
Вторую аликвоту испытательной смеси по п. 4.3 объемом 0,25
куб. см после упаривания перерастворить в охлажденной до 5 - 8
град. C воде, подкисленной уксусной кислотой до pH 4,0, и
сконцентрировать в условиях п. 7.5.1 на подготовленном (см. п.
7.3.1) патроне Диапак П-3. После элюирования и высушивания упарить
этилацетатный экстракт досуха в токе азота при температуре 35 - 40
град. C, немедленно перерастворить в 0,25 куб. см растворителя,
соответствующего конечному хроматографическому определению, и
проанализировать аналогично градуировочному эксперименту по п.
4.3, получив значения C (S ) и C'(S').
гр гр
Рассчитать значение K по формуле (1). Значение K = 1,00.
R d
Коэффициент извлечения K для патулина должен быть не менее 80%.
R
Вторую аликвоту испытательной смеси по п. 4.2 объемом 0,25
куб. см после упаривания перерастворить в 20 мл 5-процентного
ацетонитрила в воде и нанести в соответствии с п. 6.4.1 на
подготовленный по п. 6.3.1 патрон Диапак С16М. После элюирования и
высушивания упарить хлороформный экстракт М на ротационном
испарителе при температуре не выше 40 град. C, немедленно
перерастворить его в 0,25 - 1,0 куб. см растворителя,
соответствующего конечному хроматографическому определению, и
проанализировать аналогично градуировочному эксперименту по п.
4.2, получив значения C (S ) и C'(S') для афлатоксина М1.
гр гр
Рассчитать K по формуле (1) K = 1,00. Коэффициент извлечения,
R d
K , по афлатоксину М1 должен быть не менее 95%.
R
Вернуться в "Каталог нормативных документов"
Источник информации: https://internet-law.ru/documents/prod/metodika/6/muk_4_75384.html
На правах рекламы:
|
© Антон Серго, 1998-2026.
|
Разработка сайта |
|