"Методика определения биосовместимости полимерных материалов и изделий для эндопротезирования по их влиянию на лимфоидную ткань"
(утв. Минздравом СССР 27.11.1985)

В связи со все увеличивающимся объемом разработок новых материалов и изделий особое значение приобретает разработка экспресс-методов на биологических тест-объектах и тест-системах. Эти методы можно применять в следующих случаях: а) при отборе оптимальных лабораторных образцов материалов и изделий на первом этапе их разработки; б) при оценке различных технологий переработки материалов в изделие; в) при выборе оптимального способа стерилизации изделия; г) при незначительном изменении рецептуры материала; д) при изменении сферы применения хорошо изученного материала.

При непосредственном введении материалов во внутреннюю среду организма способность их вызывать состояние сенсибилизации иммунокомпетентных систем во многом определяет степень совместимости материала с организмом (биосовместимость).

Современная неинфекционная иммунология располагает методами, позволяющими оценить степень биосовместимости вживляемых материалов по характеру их влияния на органы иммунитета, представляемые в организме лимфоидной тканью.

Настоящая Методика предполагает комплекс методов оценки состояния лимфоидной ткани при имплантации синтетических материалов. Эти методы апробированы и адаптированы к задачам токсикологической оценки полимеров медицинского назначения.

Комплекс предлагаемых методов предназначается для использования в качестве экспресс-метода оценки биосовместимости при отборе перспективных для медицины полимерных материалов, а также в качестве этапа токсикологического изучения при гигиенической оценке материалов и изделий, длительно контактирующих с внутренними средами организма.

2.1. Материалы для пластики тканей, изготовления эндопротезов или частей и деталей к ним.

2.2. Клеи медицинского назначения.

2.3. Шовные и перевязочные материалы.

2.4. Материалы для микрокапсулирования лекарственных средств.

2.5. Крове- и плазмозаменители.

3.1. Твердые материалы должны иметь форму, удобную для имплантации. Предпочтительна форма в виде бруска, имеющего размеры 6 x 4 x 2 мм (грани бруска и углы не должны быть острыми).

3.2. Жидкие, порошкообразные и вспенивающиеся материалы готовятся для имплантации в виде порций по 0,5 куб. см (0,5 мл).

3.3. Тканые и пленочные материалы должны иметь размеры 10 x 10 кв. мм.

3.4. Все материалы, подлежащие оценке на биосовместимость, должны быть стерильны. Способ стерилизации должен соответствовать ОСТ 42-21-2-85 "Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения", отобранному для данного вида изделий.

4.1. Вид животных: белые крысы - самцы линии Вистор или беспородные.

4.2. Количество групп животных в эксперименте должно быть не менее четырех: а) подопытная; б) контроль интактный; в) контроль ложнооперированный; г) контрольная имплантация традиционного биосовместимого материала.

4.2.1. В качестве традиционного биосовместимого материала при оценке нерассасывающихся имплантатов следует применять тефлон, для рассасывающихся - кетгут, для кровезаменителей - поливинилпирролидон мол. массы 12600, для порошкообразных - порошок тефлона или кетгута, для сплавов - сплав КХС.

4.3. Количество животных в группе - не менее 6 голов.

4.4. Продолжительность эксперимента - 1 месяц.

4.5. Сроки взятия лимфоидных органов - через 2 недели и через 4 недели после имплантации.

4.6. Техника операции: под нембуталовым наркозом (доза 40 мг/кг) на наружной поверхности верхней трети бедра крысы делается разрез кожи длиной около 1 см. Анатомическим глазным пинцетом расчленяется бедренная мышца (вдоль волокон), в которой при помощи того же пинцета формируется карман. Изучаемый материал помещается в этот карман. На мышцу накладывается один шов, на кожу два шва. Применяется хирургический шелк высоких номеров.

Одной из контрольных групп животных имплантируется биосовместимый материал, другой - производится ложная операция (те же манипуляции без имплантации материала).

4.6.1. В случае изучения жидких или вспенивающихся материалов имплантация производится инъекционным способом.

5.1. Патоморфологический анализ отпечатков лимфатических узлов.

5.1.1. Взятие материала и приготовление отпечатков.

Животные забиваются методом декапитации. При вскрытии извлекается правый (регионарный к месту имплантации) и левый (отдаленный) лимфоузлы, освобождаются от жировой ткани и острым лезвием перерезаются поперек. При помощи пинцета половинка узла прикладывается несколько раз к обезжиренному предметному стеклу поверхностью среза.

Отпечатки высушиваются на воздухе при комнатной температуре, затем фиксируются метанолом в течение двух минут (или спиртом-ректификатом в течение 15 мин.) и промываются проточной водой. Окраска отпечатков производится стандартными растворами красителей Май-Грюнвальд (в течение 4 мин.) и азур-эозиновой смесью (10 мл красителя на 100 мл дистиллированной воды); окрашивать в течение 45 - 60 мин.

5.1.2. Проведение анализа отпечатков и техника оформления получаемых результатов.

Отпечатки изучаются под микроскопом с применением иммерсии. В отпечатках производится подсчет иммунокомпетентных клеток: малых лимфоцитов, бластов, зрелых плазматических клеток и ретикулярных клеток, а также количество делящихся клеток (митозов).

Подсчет клеток производится в 10 полях зрения, и в дальнейшем принимаются во внимание средние (М) из 10 полей зрения показатели для каждого из видов клеток. Поля зрения берутся в разных частях отпечатков, преимущественно в парокортикальных зонах и у основания мозговых тяжей.

Запись протокола подсчета клеток производится по нижеприведенному образцу (табл. 1).

5.2.1. Взятие материала и приготовление мазков.

Взятие материала. Забой животных и взятие материала производится так же, как в п. 5.1.1. Можно использовать лимфоузлы, из которых готовились отпечатки.

Приготовление мазков. На предметное стекло в каплю физиологического раствора помещается лимфоузел. Затем при помощи двух инъекционных игл ткань органа размельчается в этой капле до получения гомогенной взвеси. Из капли обычным образом готовится мазок, который высушивается на воздухе при комнатной температуре.

Фиксация мазков. Приготовление фиксатора: готовится 60% раствор ацетона (60 мл ацетона и 40 мл дистиллированной воды), куда добавляется трилон (250 мг на 100 мл 60% раствора ацетона); pH раствора 4,8 - 5,0 (доводить pH 0,1 раствором HCl).

Высушенные мазки фиксируются в ацетоновом фиксаторе в течение 30 с, затем промываются в проточной воде и высушиваются на воздухе.

5.2.2. Выявление сукцинатдегидрогеназы и бета-глицерофосфат-дегидрогеназы.

Приготовление фосфатного буфера:

а) приготовить раствор калия фосфорнокислого однозамещенного с мол. весом 136,09 (3,78 г растворяют в 100 мл воды);

б) приготовить раствор калия фосфорнокислого двузамещенного (4,56 г растворить в 100 мл воды);

в) оба раствора слить для получения pH = 7,0 - 7,4 (30 мл раствора калия однозамещенного и 70 мл раствора калия двузамещенного).

Буфер хранить в холодильнике.

Приготовление инкубационной среды для выявления сукцинатдегидрогеназы (СДГ):

а) 10 мг трилона Б; б) 540 мг сукцината натрия; в) 10 мг паранитротетразолия фиолетового; г) 40 мл фосфатного буфера.

Приготовление инкубационной среды для выявления бета-глицерофосфатдегидрогеназы (бета-ГДГ):

а) 10 мг трилона Б; б) 650 мг бета-глицерофосфата; в) 10 мг паранитротетразолия фиолетового; г) 10 мг фосфатного буфера.

Примечание: п-нитротетразолий лучше добавить после того, как pH среды будет доведен до рабочего.

Приготовление красителя метилового зеленого: 2,7 г уксуснокислого натрия растворить в 100 мл дистиллированной воды, довести ледяной кислотой до pH 4,8 - 5,0 (1,5 мл) 500 мг метилового зеленого растворить в 100 мл шуфера из уксуснокислого натрия. Смесь очищают при помощи делительной воронки хлороформом до тех пор, пока хлороформ не станет чистым.

Выявление ферментов и окраска мазков. Зафиксированные мазки помещают в одну из инкубационных сред (в зависимости от того, какая дегидрогеназа выявляется) и нагревают до 38 - 39 °C, после чего помещают в термостат (37 °C) на 60 минут. После инкубации мазки промывают в проточной воде и окрашивают метиловым зеленым в течение 60 минут. Затем следует отмывка препаратов.

5.2.3. Проведение анализа мазков и техника оформления полученных результатов.

Подсчет гранул ферментов в клетках производится под микроскопом с применением иммерсии. В окрашенном препарате лимфоциты и прочие клетки лимфоидного ряда имеют бледно-зеленую окраску. Гранулы фермента располагаются в ядре и цитоплазме, имеют округлую сферическую форму и темно-фиолетовый (почти черный) цвет. Техника анализа мазка предполагает подсчет количества гранул в 50 клетках, последние считают в разных полях зрения, в разных участках мазка.

Активность фермента в клетке выражается средним количеством гранул в одной клетке (общее количество гранул в 50 клетках, деленное на 50). Запись протокола подсчета гранул фермента производится по нижеприведенному образцу ("0" обозначает отсутствие фермента в клетке).

Коэффициент активности фермента в этом случае равен 158 / 50 = 3,74.

5.3. Гистохимическое выявление рибонуклеиновой кислоты в ткани селезенки по методу Браше.

5.4. Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы в лимфоузлах по методу Гомори.

5.5. Определение весовых коэффициентов тимуса и селезенки.

5.6. Оценка результатов экспериментов.

Для оценки степени совместимости материала главное значение имеют данные цитоморфологического анализа лимфоузлов. Эти данные должны получить подтверждение в результате гистохимического исследования селезенки и анализа весовых коэффициентов лимфоидных органов.

Цитохимическое определение сукцинатдегидрогеназы и бета-гли-церофосфатдегидрогеназы проводится факультативно, но обязательно в совокупности с гистохимическим определением щелочной фосфатазы в лимфоузлах.

Материал следует считать биологически несовместимым, если через 1 месяц после имплантации материалов не наблюдается нормализации показателей или выраженной тенденции к таковой и отличия их от контроля существенны (статистически достоверны).

В случае если показатели состояния лимфоидной ткани подопытных животных отличаются от контроля менее существенно (носят характер тенденции к изменению Р, равном или меньше 0,1), вопрос о биологической совместимости исследуемого материала должен решаться с учетом всей совокупности данных токсикологического эксперимента.

5.6.1. Статистическая обработка данных.

Для цифровых показателей, получаемых методами, указанными в п. п. 5.1; 5.2.3; 5.5, - статистическая обработка обязательна. Она проводится с использованием критерия "t" по Стьюденту. Для результатов цитохимических исследований (п. 5.2.3) предпочтительнее метод Уилкоксона - Манна - Уитна.

Результаты, полученные в опытной группе животных, сравниваются с контролем, которому вживлялся "инертный материал". Если этот контроль не имеет достоверных отличий от ложнооперированного контроля, опытная группа может быть сравнена непосредственно с интактным контролем.