"Р 52.24.808-2014. Рекомендации. Оценка токсичности поверхностных вод суши методом биотестирования с использованием хлорофилла a"
(введены в действие Приказом Росгидромета от 23.04.2014 N 204)

1 РАЗРАБОТАНЫ Федеральным государственным бюджетным учреждением "Гидрохимический институт" (ФГБУ "ГХИ")

2 РАЗРАБОТЧИКИ Е.Н. Бакаева, д-р биол. наук, Н.А. Игнатова, канд. биол. наук, Г.Г. Черникова

3 СОГЛАСОВАНЫ с ФГБУ "НПО "Тайфун" 29.01.2014

УМЗА Росгидромета 04.03.2014

4 УТВЕРЖДЕНЫ Заместителем Руководителя Росгидромета 05.03.2014

ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ приказом Росгидромета N 204 от 23.04.2014

5 ЗАРЕГИСТРИРОВАНЫ ФГБУ "НПО "Тайфун" за номером Р 52.24.808-2014 от 24.03.2014

6 ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ

7 СРОК ПЕРВОЙ ПРОВЕРКИ 2019 год

Фитопланктон играет в водных экосистемах самую важную роль, поскольку является поставщиком первичной продукции. Наличие и количество пигментов, в частности хлорофилла a, его концентрация служит показателем состояния фитопланктона и позволяет судить и о трофности водного объекта, и о его токсичности, т.е. о качестве вод. Токсичность и трофность являются слагаемыми качества воды, определяемого биологическими методами - биоиндикацией и биотестированием.

Устойчивая взаимосвязь распределения хлорофилла a с гидрохимическими, гидрологическими и гидробиологическими характеристиками конкретной акватории подтверждает его широкие информационные возможности. К настоящему времени разработаны методики определения концентраций хлорофилла a с помощью разных растворителей. Абсолютные значения массовых концентраций хлорофилла a, получаемых этими методиками существенно отличаются. В этанольных вытяжках абсолютные цифры массовых концентраций хлорофилла a выше, поскольку происходит более полное экстрагирование пигмента. Кроме того безопасность для оператора и окружающей среды при использовании этанольных экстрактов значительно выше.

Содержание хлорофилла a является одной из основных функциональных характеристик природного фитопланктона пресных и солоноватых вод. В связи с этим необходимо использование экологически соответствующих тест-объектов. В данных рекомендациях изложена характеристика тест-объектов из числа микроводорослей различной систематической принадлежности: Chlorophyta - зеленые, Cyanophyta - сине-зеленые, Bacillariophyta - диатомовые, и экологических особенностей (пресноводные, солоновато-водные и морские). Приведены прописи соответствующих питательных сред и способы поддержания маточных культур микроводорослей.

Концентрация хлорофилла a - очень чувствительный, быстро меняющийся физиологический показатель. В то время как о стабильности популяции и прогнозе ее развития можно судить только по показателю размножения. Поэтому наиболее адекватной оценкой токсичности вод служит комплекс этих показателей. В данных рекомендациях приведена шкала оценки токсичности поверхностных вод, разработанная на основе комплекса двух показателей в сочетании с экспозицией биотеста.

Использование данной методики позволяет повысить результативность исследований по наблюдению за качеством поверхностных вод суши и обеспечить экологическую безопасность исследований.

Настоящие рекомендации устанавливают методику биотестирования с использованием хлорофилла a и требования к порядку проведения и оценке токсичности поверхностных вод суши в составе системы мониторинга поверхностных вод суши (далее - методика).

Методика предназначена для лабораторий, осуществляющих наблюдения за эколого-токсикологическим состоянием поверхностных вод суши в рамках государственной службы наблюдений за состоянием окружающей природной среды.

Рекомендации предназначены для использования подразделениями министерств, осуществляющих природоохранную деятельность, а также для проведения научно-исследовательских экотоксикологических и экологических работ.

В настоящих рекомендациях использованы ссылки на следующие нормативные документы:

ГОСТ Р 51592-2000 Вода. Общие требования к отбору проб

ГОСТ 17.1.04.02-90 Вода. Методика спектрофотометрического определения хлорофилла a

ISO 10260:1992 Качество воды. Измерение биохимических параметров. Спектрофотометрический метод определения концентрации хлорофилла a

Р 52.24.566-94 Методы токсикологической оценки загрязнения пресноводных экосистем

РД 52.24.662-2004 Оценка токсического загрязнения природных вод и донных отложений пресноводных экосистем методами биотестирования с использованием коловраток

РД 52.24.784-2013 Массовая концентрация хлорофилла a. Методика измерений спектрофотометрическим методом с экстракцией этанолом

Примечание - Ссылки на остальные нормативные документы приведены в разделе 4.

В настоящих рекомендациях использованы следующие термины и определения:

3.2 биотест: Совокупность приемов получения информации о токсичности воды (донных отложений) для гидробионтов на основе регистрации реакций тест-объекта (Р 52.24.566).

3.4 критерий токсичности: Значение показателя токсичности, на основании которого судят о наличии токсического действия.

3.5 острое токсическое действие (острая токсичность): Воздействие, вызывающее быструю ответную реакцию тест-объекта.

Примечание - острую токсичность чаще всего определяют по тест-реакции "гибель" или "выживаемость" в условиях кратковременного биотестирования. При использовании коловраток и других организмов микрозоопланктона длительность воздействия составляет 6 - 24 ч (Р 52.24.662).

3.7 проба воды: Количество воды, предназначенное для исследования (Р 52.24.566).

3.8 результат биотестирования: Конечный вывод о токсичности водной среды, сделанный в ходе биотестирования (Р 52.24.662).

3.9 тест-объект: Организм, который используют при биотестировании (водоросли, дафнии и т.д.) (Р 52.24.566).

3.10 тест-показатель: Показатель жизнедеятельности (поведенческие реакции, размножение, выживаемость и т.д.) тест-объекта, используемый для определения токсичности ПВС.

3.11 токсичность воды: Свойство воды вызывать развитие патологического процесса или гибель тест-объектов (Р 52.24.566).

3.12 условно чистый участок водного объекта: Обычно это фоновый створ (Р 52.24.566).

3.13 фоновый створ: Створ, расположенный на расстоянии не менее 1 км выше источника загрязнения [1].

3.14 хроническое токсическое действие (хроническая токсичность): Воздействие, вызывающее ответную реакцию тест-объекта, проявляющуюся в течение относительно длительного периода времени.

Примечание - хроническую токсичность измеряют по тест-реакциям "выживаемость", "плодовитость", "изменение роста" и другим реакциям при длительном биотестировании (Р 52.24.566).

3.15 экспозиция: Период, в течение которого организм находится под воздействием исследуемого фактора, в частности химического вещества.

Примечание - в зависимости от экспозиции различают острую или хроническую токсичность.

3.16 эталонный токсикант: Токсическое вещество, используемое для калибровки биотеста или тест-объекта (Р 52.24.566).

4.1.1 Микроскоп любого типа по ГОСТ 8074-82.

4.1.2 Устройство фильтрующее с воронками типа Зейтца под фильтры диаметром 35 мм.

4.1.3 Камера Горяева по ТУ 64-1-816-77.

4.1.4 Пипетки градуированные по ГОСТ 29230-91.

4.1.5 Колба мерная исполнения 2, по ГОСТ 1770-74 вместимостью 250 см³ - 6 шт.

4.1.6 Газ мельничный N 70 - N 74.

4.1.7 Насос вакуумный ручной.

4.1.8 Стаканы вместимостью 600 см³ по ГОСТ 25336-82.

4.2.1 Калий двухромово-кислый по ГОСТ 4220-75.

4.2.2 Питательная среда для микроводорослей.

4.2.3 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

4.2.4 Фильтры мембранные "Владипор МФАС-ОС-2", 0,35 мм по ТУ 6-55-221-1-29-89 или другого типа, равноценного по характеристикам.

4.2.5 Культура одноклеточных пресноводных зеленых микроводорослей родов Scenedesmus или Chlorella или сине-зеленых Synechocystis и морских микроводорослей родов Dunaliella, Phaeodactilum.

Примечание - Допускается использование реактивов, изготовленных по другой нормативно-технической документации, в том числе импортных с квалификацией не ниже указанной в 4.2.

5.1 Методику биотестирования по концентрации хлорофилла a применяют при использовании в биотестировании автотрофных тест-объектов, в частности:

- для оценки токсичности поверхностных вод суши используют тест-объекты из числа пресноводных зеленых Scenedesmus obliquus (Turp.) Kutz, Chlorella vulgaris Beijer и сине-зеленых Synechocystis sp. микроводорослей;

- для оценки токсичности водоемов различной солености и зон смешения речных и морских вод используют тест-объекты из числа солоновато-водных микроводорослей Dunaliella salina Teod. и Phaeodactilum tricornutum;

- для оценки как острой, так и хронической токсичности.

5.2 Тест-показатель "концентрация хлорофилла a" используют в комплексе с тест-показателем "коэффициент прироста микроводорослей" в зависимости от экспозиции.

5.3 Длительность биотестирования (продолжительность экспозиции) зависит от цели исследования:

- острую токсичность определяют за 24 ч.

- хроническую токсичность - за 96 ч.

5.4 Биотестирование ПВС проводят в режимных наблюдениях и для решения оперативных задач с целью проверки соответствия качества вод отдельных проб установленным нормам.

В режимных наблюдениях на основе систематических данных биотестирования оценивают токсическое состояние водных объектов или их участков.

В ходе решения оперативных задач оценивают токсичность отдельных проб воды с целью выяснения чрезвычайных экологических ситуаций.

5.5 В принятом на сегодняшний день перечне нормирования показателей качества вод указано: вода контрольного створа (фоновый створ) не должна оказывать хронической токсичности и тем более острой на тест-объекты, используемые для биотестирования.

5.6 В ходе биотестирования ПВС устанавливают отсутствие или наличие токсичности (острой, хронической) испытываемой пробы для тест-объектов, без идентификации загрязняющих веществ и их количественных характеристик.

5.7 Контролем служит вода из контрольного (фонового) условно чистого участка водного объекта или дехлорированная водопроводная вода региона исследования, используемая для содержания маточных культур тест-объектов.

5.8 Биотестирование проводят в трехкратной повторности.

При выполнении работ следует соблюдать общие требования к технике безопасности работ на водных объектах и в химических лабораториях.

Особых требований по экологической безопасности нет.

К выполнению экспериментальных работ методами биотестирования допускают лиц, имеющих биологическое, экологическое образование и знакомых с основами водной токсикологии и методами полевых и лабораторных гидробиологических исследований.

8.1 Пробы ПВС отбирают с учетом требований ГОСТ Р 51592 и Р 52.24.566. Объем пробы должен быть не менее 500 см³.

8.2 Сосуды должны быть из материала, не содержащего токсичных примесей (полиэтиленовые емкости для пищевых продуктов, стеклянные баллоны и бутыли). Сосуды необходимо маркировать.

8.3 Перед заполнением сосудов воду фильтруют через мельничный газ N 70 - N 74 (для удаления природного планктона) и несколько раз ополаскивают сосуд. Заполняют водой полностью.

8.4 Анализ проб воды по определению токсичности проводят не позднее 6 ч после отбора проб. В случае невозможности проведения исследований в срок, указанный в 5.3, пробы охлаждают до 4 °C или замораживают согласно ГОСТ Р 51592 и хранят до 30 сут. Консервирование проб химическими веществами не допускается.

8.5 Перед биотестированием измеряют концентрацию кислорода, значения pH (с целью дифференцирования токсического воздействия каких-либо загрязняющих веществ и измеренных значений pH и кислорода, если эти параметры не обеспечивают нормальной жизнедеятельности гидробионтов).

9.1.1 Метод основан на определении изменения концентрации хлорофилла a под влиянием испытываемой воды, отобранной из водоемов, водотоков и зон смешения морских и пресных вод, на лабораторные культуры микроводорослей экологически соответствующих тест-объектов: пресноводных зеленых Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, сине-зеленых Synechocystis aquatilis или морских зеленых Dunaliella salina и диатомовых Phaeodactilum tricornutum.

Влияние испытываемой воды оценивают по отклонению значений концентрации хлорофилла a при экспозиции в испытываемой воде по сравнению с контролем.

Показателем содержания хлорофилла a служит концентрация хлорофилла a, мкг/л, в культуре микроводорослей. Показателем интенсивности размножения - коэффициент прироста численности клеток микроводорослей.

Острую и хроническую токсичность пробы ПВС (поскольку пересев на новую воду невозможен) устанавливают в ходе одного биотеста (непрерывное биотестирование) в зависимости от времени проявления токсического эффекта. Острую токсичность устанавливают за время экспозиции 24 ч (за это время появляется 6 - 8 поколений микроводорослей), хроническую - за 96 ч.

Критерием токсичности является отклонение концентрации хлорофилла a на 50% от контроля. Отклонение в сторону уменьшения, равное -50% и более, свидетельствует об угнетающем действии испытываемой воды на микроводоросли. Отклонение значений в сторону увеличения, равное +50% и более, косвенно свидетельствует о наличии в испытываемой воде веществ, стимулирующих рост микроводорослей, например, фосфора или органических веществ.

При установлении острой токсичности по 10.3 биотестирование прекращают.

При отсутствии острой токсичности биотестирование продолжают, чтобы установить возможную хроническую токсичность (длительное биотестирование, 96 ч).

9.1.2 Характеристики используемых видов микроводорослей, условия их поддержания, состав питательных сред приведены в приложениях А, Б, В, значение фитопланктона в водной экосистеме и характеристика пигментов - в приложении Г, характеристика хлорофилла a и методы его определения - в приложении Д.

Для эксперимента используют культуру микроводорослей, находящуюся в стадии экспоненциального роста. Перед биотестированием ее концентрируют, фильтруя через мембранный фильтр. С фильтра водоросли смывают профильтрованной водой в емкость вместимостью 500 см³. Клетки водорослей можно сконцентрировать путем отстаивания культуры водорослей. Численность клеток в суспензии, которую используют в эксперименте, должна составлять от 5 до 10 млн. кл./см³.

Перед экспериментом проверяют чувствительность культуры микроводорослей воздействием эталонного токсиканта. В качестве эталонного токсиканта используют калий двухромовокислый. Критерием пригодности культуры к биотестированию является величина LC₅₀ в диапазоне концентраций от 0,4 до 0,9 мг/дм³ калия двухромовокислого за 96 ч экспозиции, т.е. в пределах таких диапазонов концентраций эталонных токсикантов происходит гибель 50% клеток микроводорослей.

В исходную (маточную) культуру микроводорослей вносят 0,1 см³ каждого питательного солевого раствора в соответствии с таблицей Д.1 (приложение Д) для пресноводных и с таблицей Д.2 (приложение Д) - для солоноватоводных микроводорослей.

9.3.1 Биотестирование проводят в нестерильных условиях при оптимальной температуре (20 +/- 2) °C и освещении от 2000 до 3000 лк с естественной сменой дня и ночи в помещениях без вредных испарений.

9.3.2 Испытываемую воду предварительно фильтруют через мельничный газ N 70 - N 74 для удаления природного зоопланктона.

9.3.3 В 3 колбы вместимостью 500 см³ добавляют по 250 см³ испытываемой воды, в 3 контрольные колбы вместимостью 500 см³ добавляют 250 см³ выбранный контроль.

9.3.4 В каждую колбу пипеткой вносят от 0,5 до 1,0 см³ сконцентрированной исходной (маточной) культуры микроводорослей.

9.3.5 Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, содержимое тщательно перемешивают и в каждой колбе определяют исходную численность клеток N_o, которая должна составлять от 250 до 300 тыс. кл./см³.

9.3.6 Колбы располагают в помещении при естественном освещении (избегая прямых солнечных лучей).

9.3.7 Для определения острой токсичности через 24 ч в каждой колбе:

- подсчитывают численность клеток для установления прироста микроводорослей;

- отбирают 100 см³ среды для определения концентрации хлорофилла a.

9.3.8 В случае отсутствия острой токсичности через 96 ч для установления хронической токсичности в каждой колбе проводят действия по 9.3.7.

9.3.9 В течение эксперимента ежедневно тщательно перемешивают содержимое колб.

Определение и расчет концентраций хлорофилла a, а также исходной концентрации хлорофилла a, проводят либо в ацетоновых вытяжках по ГОСТ 17.1.04.02 или [2], либо в этанольной вытяжке по ISO 10260:1992 или РД 52.24.784.

Наилучшее экстрагирование хлорофилла a происходит при использовании этанола.

9.5.1 Подсчет численности клеток микроводорослей осуществляют в камере Горяева, Фукс-Розенталя, т.е. в любой камере, предназначенной для подсчета форменных элементов крови. Объем камеры Горяева представляет собой сетку из 25 маленьких квадратов, составляющих объем 0,0001 см³. Микроводоросли помещают под стекло в камеру, просчитывают 25 маленьких квадратов, полученную сумму умножают на 10⁴ и получают число клеток в 1 см³ суспензии.

При подсчете клеток в камере необходимо соблюдать следующие правила:

- взятую в пипетку каплю очень быстро наносят на поверхность сетки камеры, пока клетки микроводорослей не успели осесть в нижней части пипетки;

- нанесенную на поверхность сетки каплю быстро накрывают покровным стеклом и притирают во избежание оседания клеток из капли, большей по объему, чем капля в камере после притирания стекла;

- просчитывают клетки в трех камерах и берут среднее значение.

9.5.2 Коэффициент прироста численности клеток микроводорослей в контрольной и опытной сериях К, отн. ед., рассчитывают по формуле

где N_t - численность клеток микроводорослей в контроле или в испытываемой воде через учитываемый промежуток времени, тыс. кл/см³;

N_o - исходная численность клеток микроводорослей, тыс. кл/см³.

9.5.3 Для каждой из трех повторностей рассчитывают свой коэффициент прироста численности клеток микроводорослей. Значение коэффициента прироста численности клеток микроводорослей для каждой серии (опытной и контрольной) представляет собой среднее арифметическое из значений трех полученных коэффициентов.

Первоначально рассчитывают отклонения значений коэффициента прироста микроводорослей опытных вариантов от контроля. В случае отклонения коэффициента прироста численности микроводорослей на 50% и более концентрацию хлорофилла a не определяют.

10.1.1 Отклонение коэффициента прироста численности клеток микроводорослей К_пр, %, рассчитывают по формуле

где К_оп - коэффициент прироста численности клеток микроводорослей в испытываемой воде;

К_конт - коэффициент прироста численности клеток микроводорослей в контроле.

10.1.2 Значения отклонений прироста численности микроводорослей в сериях с испытываемой водой от контроля могут иметь знаки плюс или минус.

Отклонение значений в сторону увеличения свидетельствует о наличии стимулирующего эффекта испытываемой воды на автотрофные тест-объекты, что косвенно свидетельствует о наличии органических веществ в водном объекте.

Отклонение значений в сторону уменьшения свидетельствует об угнетающем действии на автотрофные тест-объекты.

10.2.1 Отклонение полученных значений концентраций хлорофилла a от контроля К_хл, %, рассчитывают по формуле

где Х_оп - концентрация хлорофилла a микроводорослей в испытываемой воде;

Х_конт - концентрация хлорофилла a микроводорослей в контроле.

10.2.2 Значения отклонений концентраций хлорофилла a в опытных сериях от контроля могут иметь знаки плюс или минус.

Отклонение значений в сторону увеличения свидетельствует о наличии стимулирующего эффекта испытываемой воды на автотрофные тест-объекты, что косвенно свидетельствует о наличии органических веществ в водном объекте.

Отклонение значений в сторону уменьшения свидетельствует об угнетающем действии на автотрофные тест-объекты.

Оценку токсичности испытываемой пробы воды проводят по комплексу двух показателей (концентрация хлорофилла a и коэффициент прироста численности клеток микроводорослей) в зависимости от экспозиции согласно шкале (таблица 1). Оценивают токсичность проб воды по характеру токсического действия, которое оказывает испытываемая проба воды. Словесно выражают: проба "оказывает или не оказывает острую (или хроническую) токсичность".

Результаты биотестирования представляют в соответствии с приложением Е.

А.1 Характеристика тест-объекта Scenedesmus obliquus (Turp.) Kutz

А.1.1 Систематическое положение

А.1.2 Местообитание

Scenedesmus obliquus - широко распространенный в пресных поверхностных водах вид зеленых водорослей. Встречается главным образом в планктоне.

А.1.3 Морфология, биология

Данный вид относится к ценобиальным организмам. Ценобии - организмы имеющие вид плоских пластинок и состоящие из 2, 4, реже 8 и 16 клеток. Клетки удлиненно-овальные, с закругленными концами. Оболочка гладкая. Размеры клеток 7 - 45 x 2,5 - 16,0 мкм.

Размножается автоспорами. Автоспоры в материнской оболочке располагаются пучком, после освобождения разворачиваются в виде пластинки. В условиях культуры иногда вместо ценобиев образуются отдельные клетки.

А.1.4 Содержание в лабораторных условиях

Колбы для культивирования водорослей желательно стерилизовать сухим паром в течение 1 ч при 180 °C. Культуру водорослей вносят для посева в стеклянную колбу с питательной средой в количестве, дающем светло-зеленое окрашивание. Рецепт (состав) питательных сред приведен в приложении Е. Колбы закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками или колпачками из пергаментной бумаги. Водоросли культивируют в плоскодонных колбах или аквариумах при круглосуточном освещении лампами дневного света мощностью 240 Вт/м², размещенными на расстоянии от 30 до 40 см от поверхности культуры. Водоросли можно выращивать при естественном освещении, защищая от прямых солнечных лучей. Культуру водорослей периодически перемешивают, встряхивая 3 - 5 раз в сутки. Оптимальная температура для выращивания водорослей 18 - 23 °C. Подкормку водорослей производят через каждые 10 - 14 дней. Пересеивать культуру водорослей можно через 2 - 4 недели.

А.2 Характеристика тест-объекта Chlorella vulgaris Beijer

А.2.1 Систематическое положение

А.2.2 Местообитание

Chlorella vulgaris - широко распространенный вид зеленых водорослей, обитающих в различных биотопах пресноводных экосистем.

А.2.3 Морфология, биология

Chlorella vulgaris относится к одноклеточным водорослям. Клетки шаровидные, с тонкой оболочкой, без слизи. Хроматофор чашевидный, с пиреноидом. Размножается автоспорами, которые образуются по 4 - 8, реже по 16 штук, и освобождаются через разрыв в материнской оболочке. Диаметр клеток от 4,2 до 10,5 мкм.

А.2.4 Содержание в лабораторных условиях

Содержание в лабораторных условиях аналогично А.1.4.

А.3 Характеристика тест-объекта Synechocystis aquatilis Sauv

А.3.1 Систематическое положение

А.3.2 Местообитание

Пресноводные или эндофитные (живущие в слизи других водорослей) сине-зеленые. Водоросль встречается в водоемах России. Обитает в стоячих водоемах, на коре стволов, на влажных скалах, на почве, в иле. Лучшее время сбора - лето.

А.3.3 Морфология, биология

Одноклеточная сине-зеленая микроводоросль, не образующая слоевища. Клетки шаровидные, мелкие, с тонкой оболочкой, одиночные или после деления соединенные попарно, от бледных до ярких сине-зеленых, иногда желтоватые или зеленоватые. Диаметр клеток составляет от 4,5 до 6,0 мкм. Размножение без исключения делением клеток. Питается фототрофно. Размножается делением клетки пополам.

А.3.4 Содержание в лабораторных условиях

Содержание в лабораторных условиях аналогично А.1.4.

Б.1 Характеристика тест-объекта Dunaliella salina Teod

Б.1.1 Систематическое положение

Б.1.2 Местообитание

Род дуналиелла распространен на всех шести континентах Земного шара, включая Антарктиду. Dunaliella salina является солоноватоводной микроводорослью, обитающей при солености и более. Широко представлена в соленых озерах, морях. Дуналиелла является важным звеном ряда водных биоценозов. Галобионтные водоросли, в том числе дуналиелла - необходимый элемент питания ракообразных.

Б.1.3 Морфология, биология

Dunaliella salina относится к одноклеточным водорослям. Клетки без обособленной оболочки, размножающиеся в подвижном состоянии продольным делением на две клетки эллиптические или яйцевидные без продольных ребер, не сплюснуты. Хроматофор процельный с пиреноидом. Пульсирующих вакуолей нет. Жгутов два. Организмы красноватые от присутствия гематохрома. Вызывает окраску воды и кристаллизующейся соли.

Б.1.4 Культивирование

Для культивирования дуналиеллы используется среда в разбавлении отстоянной дехлорированной водой 1:3. Температура культивирования составляет (24 +/- 2) °C, освещение от 1000 до 2000 лк, продувка углекислым газом. Культуру фильтруют и обновляют на 1/3 каждые 10 сут. Для сохранения музейной культуры используют агаризованную питательную среду (0,6% агар-агара), после высева ее помещают в люминостат при температуре 5 °C, пересев производят через каждые два месяца.

Для подсчета клеток дуналиеллы их необходимо обездвижить, например, нагревом счетной камеры на спиртовке.

Б.2.1 Систематическое положение

Phaeodactylum tricornutum относится к диатомовым водорослям. Это единственный вид в роде Phaeodactylum.

Б.2.2 Местообитание

Phaeodactylum tricornutum Boohl. - супралиторальная пеннатная диатомовая водоросль. Эти водоросли являются одними из наиболее чувствительных к загрязнению. История их культивирования насчитывает 80 лет, но до 60-х годов она была известна под названием Nitzschia closterium f. Minutissima (ницшия). В отечественной марикультуре феодактилум (ницшию) применяют для выкармливания молоди устриц, артемии, коловраток.

Б.2.3 Морфология, биология

Phaeodactylum tricornutum - вид, наиболее хорошо поддающимся культивированию в лабораторных условиях. Феодактилум одноклеточная микроводоросль имеет несколько морфологических форм: веретеновидную, трехлучевую, крестообразную и овальную. Настоящий кремневый скелет и четко выраженная потребность в кремнии наблюдается только у овальной формы. Переход от одной формы в другую связан с условиями культивирования, но точные условия до конца не ясны. Размеры трехлучевой составляет от 12 до 15 мкм, веретеновидной - от 20 до 30 мкм. Темп деления 2 - 3 раза в сутки.

Б.2.4 Получение и культивирование

Выделяют Phaeodactylum tricornutum из природной морской воды. Пробы воды отбирают вдали от берега, затем ее вносят в колбы вместимостью 300 мл, в которые предварительно налита питательная среда, приготовленная согласно таблице В.3 (приложение В). Через 15 дней в большинстве колб водоросли начинают расти. Содержимое колб просматривают и отбирают отличающиеся наиболее интенсивным ростом организмы. В дальнейшем посредством частых пересевов выделяют монокультуры отдельных видов водорослей.

Культивирование феодактилум в лабораторных условиях осуществляют в колбах вместимостью 300 мл при температуре (20 +/- 2) °C и естественном освещении, избегая прямых солнечных лучей, либо при искусственном освещении 2000 лк (лампы дневного света на высоте 60 см от колб) в люминостате. Пересевать культуру водорослей необходимо один раз в 10 дней в простерилизованную колбу со свежей средой. Пересев необходимо осуществлять над пламенем спиртовки.

Культуры Scenedesmus obliquus и Chlorella vulgaris имеются в Государственных университетах Москвы, Санкт-Петербурга, ФГБУ "ГХИ" и др.

Зеленые пресноводные микроводоросли выращивают на одной из искусственных питательных сред, состав которых приведен в таблице В.1, и добавляемых в питательную среду микроэлементов (магния, цинка, молибдена, ванадия, меди), состав соединений которых приведен в таблице В.2.

Питательные среды готовят на дистиллированной воде или кипяченой водопроводной воде. Навеску каждого вещества растворяют в небольшом количестве воды, а затем растворы сливают вместе и доводят их объем до 1 дм³.

Среды Мейерса и Тамия перед внесением водорослей разбавляют в 3 - 5 раз.

Культуру водорослей вносят в среду до тех пор, пока не приобретет видимую светло-зеленую окраску. Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой.

Пересевать их можно через 2 - 3 недели или через месяц.

Морские одноклеточные микроводоросли выращивают на среде Гольдберга в модификации Кабановой, состав которой приведен в таблице В.3.

Для приготовления питательной среды Гольдберга морскую воду отбирают на условно чистом участке, фильтруют через двойной бумажный или мембранный фильтр N 4, дважды стерилизуют, нагревая на водяной бане до 75 °C, и охлаждают до комнатной температуры. В подготовленную таким образом морскую воду последовательно добавляют питательные вещества из четырех заранее приготовленных растворов (см. таблицу В.3). В морскую воду объемом 1 дм³ вносят 2 см³ раствора N 1, 0,5 см³ раствора N 2 и 1 см³ раствора N 3, затем среду стерилизуют третий раз, охлаждают и только тогда добавляют 1 см³ раствора N 4, чтобы не образовывался осадок гидроокиси железа. Полученный раствор аэрируют.

Вместо природной морской воды можно использовать искусственную морскую воду или водный раствор профессиональный морской соли (Wiegandt, производство Германия).

Г.1 Фитопланктон имеет большое значение в жизни водоемов, поскольку является основным продуцентом органического вещества в поверхностном слое воды (в пределах фотической зоны - зоны, где активно происходит фотосинтез). Фитопланктон - один из наиболее важных компонентов водных экосистем, жизнедеятельность которого определяет функционирование других организмов, и способствует самоочищению воды. Именно водорослям принадлежит главная роль в образовании органического вещества в водоемах, а также они определяют биологическую продуктивность и качество воды. Водоросли наиболее быстро реагируют на изменение условий среды и играют ведущую роль в процессах самоочищения водоемов. Это первое звено трофической (питательной) цепи водоемов.

При экологическом мониторинге пресноводных водоемов большое внимание уделяется обилию фитопланктона - основного продуцента первичного органического вещества. При развитии водорослей до степени "цветения" воды оценка обилия фитопланктона становится особенно актуальной. Однако исследования структуры фитопланктона сопряжены с трудностями количественного и качественного учета водорослей, требующего больших затрат времени и хороших знаний таксономии. Применение косвенных методов оценки развития фитопланктона, в частности спектрофотометрического определения пигментов в сестоне, получило широкое распространение с середины прошлого столетия. Исследователей привлекает доступность и быстрота определения пигментов, поэтому во многих гидробиологических работах принято выражать обилие водорослей количеством хлорофилла a.

Одноклеточные водоросли являются одними из наиболее распространенных организмов водной среды. К ним относятся представители различных систематических групп: диатомовые, перидиниевые, желто-зеленые, зеленые, протококковые. Наиболее представительными в морских водоемах являются диатомовые и перидиниевые, в пресноводных - хлорококковые микроводоросли. В силу своих физиологических особенностей одноклеточные водоросли являются наиболее чувствительными к изменениям внешней среды. Короткий цикл развития позволяет проследить на нескольких поколениях действие загрязняющих веществ. Одноклеточные водоросли используются для биотестирования широкого класса веществ (тяжелые металлы, хлор- и фосфорорганические соединения, поверхностно-активные вещества, детергенты), сточных вод различных отраслей народного хозяйства, загрязненных природных вод и грунтов, предназначенных к дампингу.

В водной токсикологии могут быть использованы виды, нашедшие применение в практике аква- марикультуры. Так, из зеленых микроводорослей чаще всего используют Chlorella vulgaris, Scenedesmus obliquus, из диатомовых микроводорослей - Thalassiosira pseudonana, Phaeodactylum tricornutum, Sceletonema costatum, различные виды Chaetoceros.

Г.2 Пигменты фитопланктона можно разделить на две основные группы:

1) хлорофиллы;

2) каротиноиды.

Наибольший интерес представляет первая группа пигментов. Основным по количественному содержанию в клетках фитопланктона и лучшим показателем его фотосинтетической активности является хлорофилл a. Содержание хлорофилла a в планктоне показывает хорошее соответствие с трофическим статусом водоемов. На основании ряда исследований были установлены концентрации хлорофилла a, мкг/л, характерные для основных трофических типов водоемов:

- 0,1 - 1,0 для олиготрофных;

- 1,0 - 10,0 для мезотрофных;

- более 10,0 для эвтрофных водоемов.

В настоящее время содержание хлорофилла a широко используется для оценки степени эвтрофикации и интенсивности самоочищения вод.

Хлорофилл a (от греч. - зеленый и - лист), зеленый пигмент растений, с помощью которого они улавливают энергию солнечного света и осуществляют фотосинтез. Локализован в особых клеточных структурах - хлоропластах или хроматофорах и связан с белками и липидами мембран. Основу структуры молекулы хлорофилла a, составляет магниевый комплекс порфиринового цикла; в IV пиррольном кольце к остатку пропионовой кислоты присоединен высокомолекулярный спирт фитол, который придает хлорофиллу способность встраиваться в липидный слой мембран хлоропластов.

По своему строению хлорофилл a близок к другим природным комплексам порфиринов (с железом) - дыхательным пигментам - цитохромам, красящему веществу крови - гему, а также простетическим группам некоторых ферментов - пероксидазы, каталазы.

По химическому составу хлорофилл представляет сложный эфир дикарбоновой кислоты хлорофинилла. Хлорофинилл - это азотосодержащее металлоорганическое соединение, относящееся к магний-порфиринам. В центре молекулы хлорофилла расположен атом магния, соединенный с четырьмя азотами пиррольных группировок. В этих группировках хлорофилла имеется система чередующихся двойных и простых связей. Это и есть хромофорная группа хлорофилла, обуславливающая его окраску.

Результаты биотестирования представляют согласно таблицам Е.1 - Е.3.

[1] Зенин А.А., Белоусова Н.В., Гидрохимический словарь. - Л.: Гидрометеоиздат, 1988. - 238 с.

[2] Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений / Под ред. Абакумова В.А. Л.: Гидрометеоиздат, 1983. - 239 с.