"Временные методические указания по определению метаболитов ФОП, производных тио- и дитиофосфорных кислот в биоматериале методом тонкослойной и газожидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом СССР 29.07.1991 N 6072-91)

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.

Производные тио- и дитиофосфорных кислот являются основными метаболитами фосфорорганических пестицидов. Характеристика метаболитов ФОП представлена в таблице 1.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении алкилпроизводных тио- и дитиофосфорных кислот методом тонкослойной и газожидкостной хроматографии после экстракции всех анализируемых соединений из биосубстратов этилацетатом (10 мл x 3).

ТСХ-определение проводят на пластинках "Силуфол" в подвижной фазе (ПФ) гексан:ацетон (3:1). В качестве проявляющих реагентов использовали:

1) 4-(п-нитробензил)пиридин + тетраэтиленпентамин (синие пятна на белом фоне);

2) тиокетон Михлера + хлорамин (салатовые пятна на желтом фоне);

3) 2,6-дибром-N-хлорхинонимин (красно-кирпичные пятна на белом фоне);

4) бромкрезоловый зеленый (желтые пятна на зеленом фоне);

5) нингидрин (красные пятна на белом фоне);

6) диметиламинобензальдегид (белые пятна на желтом фоне).

ГЖХ-определение проводят на газовом хроматографе "Цвет-100", снабженном термоионным детектором. В качестве неподвижной фазы используют 3% OV-17 на хроматоне N-AW-HMDCS. Разделение данных метаболитов проводят в изотермическом режиме при T к. = 120 °C, T исп. = 160 °C.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода определения метаболитов ФОП при внесении веществ In vitro в организм и ткани животных, мочу, кровь приведена в таблице 2.

2.1.3. Избирательность метода

Фосфорорганические пестициды не мешают определению амилпроизводных тио- и дитиофосфорных кислот.

Этилацетат хч, ГОСТ 22300-76.

Этиловый спирт - ректификат 96-процентный, ТУ 6-09-1710-77.

Сульфат натрия хч, ГОСТ 4166-76, безводный.

4-(п-Нитробензил)пиридин ч, ТУ 6-09-1593-74.

Тетраэтиленпентамин ч, ТУ 6-09-8293-73.

Тиокетон Михлера.

Хлорамин.

2,6-Дибром-N-хлорхинонимин, ТУ 6-09-0563-73.

Бромкрезоловый зеленый, ТУ 6-09-4530-77.

Нингидрин, ТУ 6-09-10-1384-79.

Диметиламинобензальдегид чда, ТУ 6-09-3272-77.

Проявляющие реактивы: N 1 - 0,2% раствор 4-(п-нитробензил)пиридина в ацетоне и 10% раствор тетраэтиленпентамина в ацетоне; N 2 - 0,1% водный раствор хлорамина и 0,1% метанольный раствор тиокетона Михлера; N 3 - 0,5% раствор 2,6-дибром-N-хлорхинонимина в гексане; N 4 - 0,3% раствор бромкрезолового зеленого в 80% метаноле смешивают с 8 каплями 30% раствора NaOH на 100 мл раствора; N 5 - 0,25% раствор нингидрина в спирте; N 6 - 10 мл 0,25% раствора п-диметиламинобензальдегида в этаноле смешивают перед употреблением с 1 мл ледяной уксусной кислоты.

Ацетон хч, ГОСТ 2603-79, свежеперегнанный.

Гексан хч, ТУ 6-09-3375-78, свежеперегнанный.

Метиловый спирт хч, ГОСТ 6996-77.

Натрий гидроксид хч, ГОСТ 4328-77.

Уксусная кислота осч, ГОСТ 18270-72, ледяная.

Неподвижная фаза: 3% OV-17 на хроматоне N-AW-HMDCS (0,16 - 0,20 мм, Хемапол, ЧССР).

Азот особой чистоты, содержание O₂ не более 0,003%, ГОСТ 9293-74.

Водород газообразный из баллона, ГОСТ 3022-80.

Воздух газообразный из баллона, ГОСТ 9.010-80, или нагнетаемый компрессором.

Основные стандартные растворы метаболитов ФОП в ацетоне по 100 мкг/мл. Хранят в холодильнике 2 мес. Рабочие стандартные растворы метаболитов ФОП, производных тио- и дитиофосфорной кислот по 100 мкг/мл и 1 мкг/мл. Хранят в холодильнике в течение 2-х месяцев.

Газовый хроматограф с термоионным детектором (ТИД) марки "Цвет-100".

Микроизмельчитель тканей РТ-2, ТУ 64-1-1505-79.

Прибор для отгонки растворителей (ротационный вакуумный испаритель) типа ИР-1-М, ТУ 25-11-917-76 или аналогичный.

Микрошприцы на 10 мкл, МШ-10, ТУ 5Е-2-833.024.

Механический встряхиватель, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный.

Хроматографическая камера с притертой крышкой, ГОСТ 25336-82.

Мерные колбы, ГОСТ 1770-74 на 100 и 50 мл.

Пипетки на 1, 5, 10 мл, ГОСТ 20292-74.

Пробирки с пробками на шлифах, градуированные, ГОСТ 1770-74, на 10 мл.

Круглодонные колбы, ГОСТ 25336-82, на 100, 50 мл.

Плоскодонные колбы, ГОСТ 25336-82, на 100 мл.

Чашки Петри, ГОСТ 25336-82.

Мерные цилиндры, ГОСТ 1770-74, на 100 мл.

Делительные воронки на 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические, ГОСТ 25336-82.

2.4.1. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб для определения микроколичеств пестицидов в сельскохозяйственной продукции, продуктах питания и объектах окружающей среды", утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 за N 2051-79.

2.4.2. Подготовка к определению

Хроматографические камеры за 1 час до начала хроматографирования заполняют смесью растворителей гексан - ацетон (3:1) для подвижной фазы. Объем подвижного растворителя в камере должен по высоте находиться не выше чем 1 см от уровня дна камеры. Для ГЖХ-определения колонка заполняется общепринятым в хроматографии способом, кондиционируется в течение 48 часов при температуре на 20° выше рабочей температуры колонки.

2.5.1. Экстракция и очистка экстракта

Органы и ткани (печень, почки, легкие, головной мозг)

Исследуемые органы и ткани измельчают в микроизмельчителе тканей или на мясорубке. Отбирают 2 - 5 г средней пробы, заливают в зависимости от взятой навески 15 - 50 мл этилацетата и оставляют на 1 час, периодически перемешивая пробу стеклянной палочкой, или ставят на 30 мин. на аппарат для встряхивания. Затем растворитель сливают в круглодонную колбу для упаривания, фильтруя экстракт через фильтр с безводным сульфатом натрия. Заливают пробу новой порцией растворителя и экстрагируют еще 30 мин. Экстракт объединяют. Упаривают экстракт на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани 40 - 45 °C до 1 мл. Переносят остаток в мерную пробирку со шлифом, ополаскивая колбу небольшими порциями (по 0,3 - 0,4 мл) этилацетата. Доводят объем в пробирке этилацетатом точно до 2 мл, перемешивают и аликвоту хроматографируют.

Кровь. 2 - 5 мл цельной крови выливают в фарфоровую чашку. Затем прибавляют при непрерывном помешивании безводный сернокислый натрий (20 г) и тщательно растирают пестиком. Приливают 20 - 30 мл этилацетата и перемешивают пробу с этилацетатом в течение 10 мин. Сливают этилацетат в колбу для отгонки растворителей, фильтруя через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще раз. Экстракты объединяют, упаривают на ротационном испарителе при температуре бани 40 - 45 °C до 1 - 2 мл. Переносят остаток в мерную пробирку и доводят объем в пробирке этилацетатом до 2 мл. Аликвоту хроматографируют.

Моча. 20 мл мочи переносят в делительную воронку, прибавляют 80 мл этилацетата. Осторожно встряхивают в течение 2 мин. Дают отстояться. Отделяют верхний слой этилацетата, сливая его через сернокислый натрий. Операцию экстрагирования повторяют дважды. Объединенные экстракты переносят в колбу для отгонки растворителей и далее поступают, как описано для крови.

2.5.2. Хроматографическое определение

Условия хроматографического определения

ТСХ

Остаток после концентрирования рабочей пробы наносят с помощью капилляра на пластинку "Силуфол". Аналогичным путем наносят серию стандартных растворов.

Хроматограмму развивают в системе гексан - ацетон (3:1). После развития хроматограммы пластинку сушат, а затем проявляют одним из проявляющих реагентов.

При проявлении хроматограмм проявляющим реагентом N 2 хроматограмму обрабатывают 0,1% водным раствором хлорамина и через 10 мин. 0,1% раствором тиокетона Михлера в метаноле или этаноле. Зоны локализации метаболитов обнаруживаются в виде салатных пятен на желтом фоне. Линейный диапазон определения 0,1 - 10 мкг.

При проявлении пластин проявляющим реагентом N 3 пластины обрабатывают 0,5% раствором 2,6-дибром-N-хлорхинонимина в гексане и нагревают 3 - 5 мин. при температуре 110 - 140 °C. Изучаемые соединения образуют красные пятна на белом фоне. Линейный диапазон - 1 - 20 мкг.

Проявляющий реактив N 4 готовят перед опрыскиванием смешиванием 0,3% раствора бромкрезолового зеленого в 80% метаноле с 8 каплями 30% раствора NaOH на 100 мл раствора. После опрыскивания тио- и дитиофосфорные кислоты проявляются в виде желтых пятен на зеленом фоне. Линейный диапазон определения 1 - 20 мкг.

При проявлении пластинки проявляющим реактивом N 5 10 мл 0,25% раствора нингидрина в спирте смешивают с 1 мл концентрированной уксусной кислоты и обрабатывают пластинку. Метаболиты ФОП проявляются в виде красных пятен на белом фоне. Линейный диапазон определения 1 - 10 мкг.

При проявлении хроматограмм проявляющим реагентом N 6 смешивают 10 мл 0,25% раствора п-диметиламинобензальдегида в этаноле с 1 мл ледяной уксусной кислоты и равномерно обрабатывают пластинку. Затем помещают в сушильный шкаф, нагретый до температуры 110 °C, на 7 - 10 мин. Метаболиты образуют белые пятна на желтом фоне.

ГЖХ

Хроматограф марки "Цвет-100" с термоионным детектором.

Колонка стеклянная спиральная, длина 1 м, диаметр 3 мм, заполненная 3% OV-17 на хроматоне N-AW-HMDCS (0,16 - 0,20 мм).

Скорость протяжки диаграммной ленты 240 мм/час.

Расход газа-носителя азота 22 мл/мин., водорода - 14 - 17 мл/мин., воздуха - 400 мл/мин.

Температура колонки 120 °C, температура испарителя 160 °C.

Время удерживания и пределы обнаружения исследуемых соединений при указанных выше условиях ГЖХ-определения приведены в таблице 3.

Метод ТСХ

Количественное определение проводят путем сравнения площади и интенсивности пятен рабочей пробы и серии стандартов.

Содержание метаболитов в анализируемой пробе X в мг/кг вычисляют по формуле:

ГЖХ

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Для этого до и после анализа проб вводят в хроматограф по 3 - 5 мкл рабочих стандартных растворов (см. табл. 3). Измеряют высоту пиков и вычисляют среднее арифметическое из 5 определений. Если при введении в хроматограф аликвотной части (3 - 5 мкл) конечного экстракта пробы получают слишком большие пики, пробу разбавляют ЭА. Для определения метаболитов ФОП анализ проб следует проводить при температуре колонки (120 °C), использовав соответствующие стандарты (см. табл. 3).

Расчет результатов анализа проводят по следующей формуле:

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями и токсическими веществами.