"ГОСТ Р 57600-2017. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукция микробиологическая. Комплексная силосная закваска. Технические условия"
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 11.08.2017 N 870-ст)

1 РАЗРАБОТАН Ассоциацией "Некоммерческое партнерство Координационно-информационный центр государств - участников СНГ по сближению регуляторных практик" при участии ООО "Центр промышленной биотехнологии имени княгини Е.Р. Дашковой"

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 326 "Биотехнологии"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 11 августа 2017 г. N 870-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт распространяется на комплексную бактериальную силосную закваску (далее - КСЗ), предназначенную для силосования кормов.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 8.579 Государственная система обеспечения единства измерений. Требования к количеству фасованных товаров в упаковках любого вида при их производстве, расфасовке, продаже и импорте

ГОСТ 12.2.003 Система стандартов безопасности труда. Оборудование производственное. Общие требования безопасности

ГОСТ 12.3.002 Система стандартов безопасности труда. Процессы производственные. Общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.028-76 Система стандартов безопасности труда. Респираторы ШБ-1 "Лепесток". Технические условия

ГОСТ 12.4.253 (EN 166) Система стандартов безопасности труда. Средства индивидуальной защиты глаз. Общие технические требования

ГОСТ 975 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия

ГОСТ 1625 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2226 Мешки из бумаги и комбинированных материалов. Общие технические условия

ГОСТ 2493 Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия

ГОСТ 3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3769 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4147 Реактивы. Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4204 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4233 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4523 Реактивы. Магний сернокислый 7-водный. Технические условия

ГОСТ 4525 Реактивы. Кобальт хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4530 Реактивы. Кальций углекислый. Технические условия

ГОСТ 4919.1 Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления растворов индикаторов

ГОСТ 5556 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия

ГОСТ 5789 Реактивы. Толуол. Технические условия

ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 8253 Мел химически осажденный. Технические условия

ГОСТ 9147 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9412 Марля медицинская. Общие технические условия

ГОСТ 10163 Реактивы. Крахмал растворимый. Технические условия

ГОСТ 12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13805 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия

ГОСТ 14192 Маркировка грузов

ГОСТ 16280 Агар пищевой. Технические условия

ГОСТ 17206 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 17811 Мешки полиэтиленовые для химической продукции. Технические условия

ГОСТ 20010 Перчатки резиновые технические. Технические условия

ГОСТ 20264.1 Препараты ферментные. Методы определения органолептических, физико-химических и микробиологических показателей

ГОСТ 22967 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28498 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29169 (ИСО 648) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 32029 (EN R57) Термостаты (терморегуляторы) механические для газовых приборов. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ Р 8.857 Государственная система обеспечения единства измерений. pH-метры. Методика поверки

ГОСТ Р 51232 Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества

ГОСТ Р 53228 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 53358 Продукты пивоварения. Термины и определения

ГОСТ Р 54731 Дрожжи хлебопекарные прессованные. Технические условия

ГОСТ Р 54951 Корма для животных. Определение содержания влаги

ГОСТ Р 55301 Дрожжи кормовые из зерновой барды. Технические условия

ГОСТ Р 57087 Закваски бактериальные для силосования кормов сухие. Технические условия

ГОСТ Р 57221 Дрожжи кормовые. Методы испытаний

ГОСТ Р 57233 Продукция микробиологическая. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ Р 57234 Продукция микробиологическая. Упаковка, маркировка, транспортировка и хранение

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется принять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется принять в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 амилолитический молочно-кислый стрептококк; АМС: Закваска, получаемая на основе чистой культуры Streptococcus lactisdiastaticus.

3.2 пентозосбраживающие молочно-кислые бактерии; ПМБ: Закваска, получаемая на основе чистой культуры Lactobacterium pentoaceticum.

3.3 пропионовокислые бактерии; ПКБ: Закваска, получаемая на основе чистой культуры Propionibacterium shermanii.

3.4 лактобактерии; ЛБ: Закваска, получаемая на основе чистых культур Streptococcus lactisdiastaticus и Lactobacillus plantarum.

4.1 КСЗ предотвращают перекисание, плесневение силоса, обогащают его витамином B₁₂. Их получают на основе чистых культур молочно-кислых бактерий.

КСЗ должна соответствовать требованиям настоящего стандарта и изготовляться по технологическому регламенту, утвержденному в установленном порядке.

КСЗ являются специализированными биоконсервантами, применяемыми при силосовании растительного сырья:

- злаковых и бобовых трав;

- однолетних злаково-бобовых смесей;

- кукурузы, сорго, подсолнечника;

- жома свекловичного;

- соломы зерновых и пропашных культур;

- влажного зерна.

Содержание (АМС + ПМБ + ПКБ + ЛБ) позволяет использовать закваски при силосовании кукурузы, сорго, подсолнечника в чистом виде, кукурузы в смеси с бобовыми (соя, горох), злаковыми (пшеница, рожь, ячмень); дикорастущих трав: люцерны, тростника, соломы, грубостебельчатых остатков кукурузы.

4.4 КСЗ выпускается в виде жидкости и сухого порошка согласно ГОСТ Р 57087. Для производства препарата используют сырье и вспомогательные материалы, указанные в технологическом регламенте.

4.5 По органолептическим, физико-химическим и биологическим показателям КСЗ должна соответствовать требованиям, указанным в таблице 1.

5.1 КСЗ нетоксична для человека и теплокровных животных.

5.2 В производстве закваски не используют токсичные вещества, она не образует токсичных соединений в воздушной среде и водных растворах.

5.3 Требования безопасности к производственному процессу - по ГОСТ 12.3.002, к производственному оборудованию - по ГОСТ 12.2.003.

5.4 При изготовлении и применении препарата необходимо пользоваться спецодеждой и индивидуальными средствами защиты:

- для глаз - очками по ГОСТ 12.4.253;

- для рук - перчатками по ГОСТ 20010;

- для органов дыхания - респиратором ШБ-1 "Лепесток" по ГОСТ 12.4.028-76.

5.5 Во время работы не следует курить, пить, принимать пищу. После работы необходимо вымыть руки и лицо с мылом.

5.6 К работе с препаратом не допускаются лица с хроническими воспалительными заболеваниями органов дыхания, зрения, кожи, склонные к аллергическим реакциям, беременные женщины, кормящие матери и подростки до 18 лет.

5.7 Всех работников, контактирующих с препаратом, подвергают периодическим осмотрам в соответствии с [1].

КСЗ сдают и принимают в установленном порядке в соответствии с требованиями ГОСТ Р 57233.

7.1 Отбор проб проводят в соответствии с требованиями ГОСТ Р 57233.

Для отбора точечных проб силосной закваски используют щуп вместимостью не более 50 г.

Масса объединенной пробы - не менее 500 г.

Определение внешнего вида и цвета КСЗ проводят визуально по каждой единице фасовки в момент отбора точечной пробы.

7.3 Определение массовой доли влаги сухих силосных заквасок проводят по ГОСТ Р 54951.

Метод основан на способности молочно-кислых бактерий окислять глюкозу в молочную кислоту, что приводит к снижению pH в суспензии микроорганизмов. При соблюдении постоянных условий скорость измерения pH пропорциональна числу жизнеспособных клеток. За 100 условных единиц активности принимают такое количество биомассы живых клеток молочно-кислых бактерий, которое снижает в растворе глюкозы с массовой долей 0,5% значение pH с 7,2 до 6,2 в течение 1 ч.

7.4.1 Аппаратура, материалы, реактивы:

- весы лабораторные общего назначения по ГОСТ Р 53228;

- встряхиватель с частотой встряхивания 100 - 120 об./мин;

- pH-метр по ГОСТ Р 8.857;

- термометр жидкостной стеклянный по ГОСТ 28498;

- часы;

- стаканы по ГОСТ 25336;

- цилиндры по ГОСТ 1770;

- глюкоза кристаллическая гидратная по ГОСТ 975;

- натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 20%;

- вода питьевая по ГОСТ Р 51232.

2,00 г КСЗ помещают в стакан вместимостью 200 см³, приливают 100 см³ воды температурой (20 +/- 1) °C и перемешивают стеклянной палочкой до получения однородной суспензии. К суспензии добавляют 0,50 г глюкозы и тщательно перемешивают. С помощью раствора гидроокиси натрия pH суспензии доводят до значения 7,2. Стакан суспензии помещают на встряхиватель и выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре 20 °C - 25 °C, после чего вновь доводят pH до начального значения 7,2 и встряхивают еще 1 ч, а затем измеряют конечное значение pH. Испытание проводят в трех параллельных определениях.

Значение снижения pH принимают по средней из результатов трех параллельных определений. Результат, отличающийся более чем на 30% от средней, отбрасывают и вычисление средней повторяют.

Кислотообразующую активность препарата определяют по таблице 2.

Метод основан на приготовлении ряда последовательных разведений силосной закваски в стерильной воде и высевом их в агаризованную среду с последующим подсчетом выросших колоний.

7.5.1 Аппаратура, материалы и реактивы:

- баня водяная;

- сушильный шкаф, обеспечивающий нагрев до температуры 150 °C;

- мешалка магнитная;

- термостат по ГОСТ 32029;

- pH-метр по ГОСТ Р 8.857;

- весы лабораторные общего назначения по ГОСТ Р 53228;

- колбы по ГОСТ 25336;

- чашки ЧБН по ГОСТ 25336;

- пипетки по ГОСТ 29169;

- вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556;

- марля медицинская по ГОСТ 9412;

- толуол по ГОСТ 5789;

- глюкоза кристаллическая гидратная по ГОСТ 975;

- экстракт кукурузный сгущенный по действующей НД;

- мел химически осажденный по ГОСТ 8253;

- формалин технический по ГОСТ 1625;

- кобальт хлористый 6-водный по ГОСТ 4525;

- железо 3-хлористое, 6-водное по ГОСТ 4147;

- агар микробиологический по ГОСТ 17206 или агар пищевой по ГОСТ 16280;

- вода питьевая по ГОСТ Р 51232;

- пептон по ГОСТ 13805;

- калий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 2493;

- натрия гидроокись по ГОСТ 4328;

- магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523;

- крахмал растворимый по ГОСТ 10163;

- кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор с массовой долей 20% или

- кислота серная по ГОСТ 4204, раствор с массовой долей 20%;

- кальций углекислый по ГОСТ 4530;

- аммоний сернокислый по ГОСТ 3769;

- натрий хлористый по ГОСТ 4233;

- сусло пивное по ГОСТ Р 53358;

- дрожжи кормовые по ГОСТ Р 55301 или дрожжи пекарские по ГОСТ Р 54731 или

- дрожжевой автолизат кормовых дрожжей сухой по ГОСТ Р 57221;

- фенолфталеин по ГОСТ 4919.1

7.5.2.1 Подготовка пластинчатого агара

Пластинчатый агар насыпают в марлевый мешок, который помещают в теплую (не выше 50 °C) воду, и промывают до тех пор, пока промывные воды не будут чистыми, без содержания механических примесей. Затем агар отжимают и раскладывают тонким слоем на лотки или бумагу для высушивания. Высушивание проводят при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре не выше 60 °C до исходной влажности агара. Агар хранят в закрытой посуде.

7.5.2.2 Приготовление автолизата дрожжей

При отсутствии сухого автолизата дрожжей его готовят из кормовых дрожжей или пекарских.

100,0 г дрожжей тщательно перемешивают с 300 см³ прокипяченной и охлажденной до температуры 56 °C - 53 °C воды и помещают в термостат при температуре (55 +/- 1) °C на 48 ч.

Периодически дрожжи перемешивают. По истечении двух суток автолиз заканчивают. К автолизату добавляют 200 см³ воды и стерилизуют при температуре 120 °C в течение 30 мин.

Затем автолизат дрожжей охлаждают до комнатной температуры и определяют содержание аминного азота следующим образом: 10 см³ автолизата помещают в колбу вместимостью 250 см³, добавляют 30 см³ дистиллированной воды и титруют раствором гидроокиси натрия концентрацией, равной 0,1 моль/дм³ (0,1 н) с фенолфталеином до слабо-розового окрашивания (pH = 6,8). Этот объем щелочи в расчете не учитывают. Затем добавляют 5 см³ нейтрализованного щелочью раствора с массовой долей формалина 40% и вторично титруют раствором гидроокиси натрия концентрацией, равной 0,1 моль/дм³ (0,1 н) до pH = 9,1. Титрование проводят по pH-метру со стеклянным электродом. При работе на приборе испытуемые растворы перемешивают.

Содержание аминного азота X₂, %, вычисляют по формуле

где V₁ - объем раствора гидроокиси натрия концентрацией 0,1 моль/дм³ (0,1 н), израсходованного на титрование, см³;

1,4 - масса азота, эквивалентная 1 см³ раствора гидроокиси натрия концентрацией 0,1 моль/дм³ (0,1 н), мг;

K - поправка к титру раствора гидроокиси натрия концентрацией 0,1 моль/дм³ (0,1 н);

V₂ - объем автолизата дрожжей, взятый для анализа, см³.

7.5.2.3 В таблице 3 показан состав питательной среды для выращивания культур молочно-кислых и пропионовокислых бактерий.

Кукурузный экстракт, используемый для приготовления сред, предварительно стерилизуют текучим паром в течение 30 мин при 105 °C три раза с интервалом 1 сут.

7.5.2.4 Приготовление питательной среды

В питьевую воду при температуре 18 °C - 20 °C вносят при постоянном перемешивании на магнитной мешалке стерильный кукурузный экстракт, растворимый крахмал. Смесь фильтруют через ватно-марлевый фильтр и вносят последовательно остальные компоненты, входящие в состав каждой среды, за исключением агара. Смесь подогревают до кипячения и доводят питьевой водой объем до 1 дм³, устанавливают pH = 7,0, разливают в колбы вместимостью 300 - 500 см³, добавляют расчетное количество агара, нагревают на водяной бане до его полного растворения и стерилизуют при 0,1 МПа 30 мин. После стерилизации pH должен составлять 6,8 - 7,0.

7.5.2.5 Приготовление водяной агаровой среды для ПКБ

20,00 г агара растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды при нагревании на кипящей водяной бане. Регулируют pH так, чтобы после стерилизации pH составлял 6,8 - 7,0. Среду разливают в колбы по 300 - 500 см³ и стерилизуют в автоклаве при 0,12 МПа в течение 40 мин.

Среды хранят при температуре 0 °C - 8 °C в темноте не более 5 сут.

7.5.2.6 Приготовление разведений КСЗ

1,00 г препарата помещают в колбу со 100 см³ соответствующей для каждой культуры жидкой среды или стерильной питьевой воды, получая разведение 10^-2.

Содержимое колбы тщательно взбалтывают и оставляют на 5 ч в термостате при температуре 37 °C (АМС), 30 °C - 32 °C (ПМБ) и 28 °C - 30 °C (ПКБ).

Из исходного разведения 10^-2 путем дальнейших десятикратных разведений в стерильном физиологическом растворе или в стерильной питьевой воде готовят разведения до 10^-9.

Для приготовления каждого разведения используют отдельные стерильные пипетки. Суспензии каждого разведения тщательно перемешивают.

Для посева культур берут стерильные чашки Петри (не менее трех на каждое разведение), в донную часть чашки вносят стерильной пипеткой, отдельной для каждого разведения, по 1 см³ суспензий силосных заквасок разведений 10^-7 и 10^-8. Затем в чашки Петри заливают 10 - 15 см³ расплавленной и охлажденной до 45 °C агаризованной питательной среды.

Содержимое чашек тщательно перемешивают путем круговых движений на гладкой поверхности стола. После полного застывания питательной среды чашки помещают в термостат.

В чашки с культурами после полного застывания заливают по 10 - 15 см³ водяной агаровой среды и помещают в термостат для выращивания культуры.

Культуру (АМС) выращивают при температуре (36 +/- 1) °C, (ПМБ) - (31 +/- 1) °C, (ПКБ, ЛП) - (29 +/- 1) °C.

Подсчет выросших колоний проводят на третьи-четвертые сутки.

Подсчет колоний проводят в тех чашках Петри, в которых их число не менее 10 и не более 200. Число жизнеспособных клеток X₃ вычисляют для каждого разведения по формуле

где P - число колоний (среднее арифметическое из трех чашек Петри, где расхождение между чашками не превышает 30%);

R - величина, обратная соответствующему разведению.

Общее число пропионово-кислых и молочно-кислых бактерий находят сложением выросших колоний.

За конечный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допустимые расхождения между которыми не должны превышать 30%.

7.6.1 Аппаратура, материалы и реактивы:

- термостат по ГОСТ 32029 или любой марки, обеспечивающий температуру нагрева (37 +/- 0,5) °C;

- чашки ЧБН по ГОСТ 25336;

- пробирки по ГОСТ 25336-82;

- пипетки по ГОСТ 29169.

Мясо-пептонный агар готовят по ГОСТ 20264.1.

Для учета посторонней микрофлоры КСЗ проводят высев из разведений 10^-5 и 10^-6. 1 см³ свежеприготовленной по 7.5.2.6 суспензии помещают в две чашки Петри. Чашки заливают 10 - 15 см³ расплавленного и охлажденного мясо-пептонного агара. Содержимое осторожно перемешивают путем круговых движений чашек. После застывания агара чашки ставят в термостат и выдерживают двое суток.

Количество посторонних микроорганизмов от количества молочно-кислых и пропионово-кислых жизнеспособных бактерий X₄, %, вычисляют по формуле

где A - число посторонних микроорганизмов (среднее арифметическое из двух чашек Петри);

P - величина, обратная разведению препарата;

B - число жизнеспособных клеток в 1 г препарата.

За конечный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, допустимое расхождение между которыми не должно превышать 30%.

7.7 Определение бактерий рода сальмонеллы - по [2].

7.8 Определение энтеропатогенных типов кишечной палочки - по [2].

7.9.1 Аппаратура, материалы:

- ступка фарфоровая по ГОСТ 9147;

- игла с наплавленной оливой, диаметром не более 1 мм;

- шприц по ГОСТ 22967;

- бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;

- вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Препарат тщательно растирают в ступке при непрерывном добавлении воды с таким расчетом, чтобы 1 см³ готовой суспензии содержал 200 мг препарата (препарат с наполнителем - отрубями предварительно измельчают до порошкообразного состояния и водный раствор фильтруют).

Отбирают пять мышей массой 19 - 21 г и вводят каждой из них через рот по 0,5 см³ суспензии на одну мышь с помощью иглы с наплавленной оливой.

Препарат считают безвредным, если все мыши остаются живыми и здоровыми в течение трех последующих суток наблюдения. В случае гибели одной мыши опыт повторяют на пяти мышах массой (20 +/- 0,5) г.

В случае гибели при первоначальном испытании двух мышей повторные испытания проводят на 15 животных. Если при повторном испытании ни одна мышь не погибнет, т.е. суммарная гибель животных в двух опытах не превысит 10%, препарат считают выдержавшим испытание. В противном случае его бракуют.

Упаковку и маркировку КСЗ проводят в соответствии с ГОСТ Р 57234.

8.1.1 Препарат фасуют по 1, 5, 10, 15 кг.

КСЗ в форме порошка фасуют массой нетто 1 - 15 кг в полиэтиленовые мешки по ГОСТ 17811. Полиэтиленовые мешки затем упаковывают в мешки бумажные по ГОСТ 2226 или мешки тканевые из полипропилена.

Жидкую закваску разливают по 1 - 100 л в канистры или бочки соответствующей вместимости из полиэтилена по действующей нормативной документации.

Допускается использование других видов упаковки, упаковочных материалов, обеспечивающих сохранность и качество продукции при транспортировании и хранении.

8.1.2 Предел допустимых отрицательных отклонений содержимого нетто от номинального количества - в соответствии с требованиями ГОСТ 8.579.

8.2.1 Транспортная маркировка - по ГОСТ 14192 с нанесением манипуляционных знаков "Ограничение температуры", "Беречь от солнечных лучей", "Беречь от влаги" (для порошка).

Транспортирование и хранение КСЗ - по ГОСТ Р 57234 при температуре от 0 °C до 8 °C.

КСЗ применяют в соответствии с наставлением по применению бактериальных заквасок для силосования кормов.

10.1 Изготовитель гарантирует соответствие КСЗ требованиям настоящего стандарта при соблюдении условий хранения и транспортирования.

10.2 Гарантийный срок хранения сухой силосной закваски - 6 мес, жидкой - 3 мес со дня изготовления.

После истечения гарантийного срока хранения допускается снижение в силосных заквасках числа жизнеспособных клеток молочно-кислых бактерий на 30%, что следует учитывать при расчете дозировок при их применении.