"ГОСТ Р 52147-2003. Национальный стандарт Российской Федерации. Белково-витаминно-минеральные и амидо-витаминно-минеральные добавки. Методы определения содержания ретинола-ацетата (витамина A), эргокальциферола (холекальциферола) (витамина D), токоферола-ацетата (витамина E)"
(принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 03.12.2003 N 342-ст)

1. Разработан Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (ОАО "ВНИИКП");

Всероссийским научно-исследовательским и технологическим институтом птицеводства (ВНИТИП);

Всероссийским научно-исследовательским институтом кормов им. В.Р. Вильямса (ВНИИК).

Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы".

2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 3 декабря 2003 г. N 342-ст.

3. Введен впервые.

Настоящий стандарт распространяется на белково-витаминно-минеральные и амидо-витаминно-минеральные добавки и устанавливает хроматографические методы определения ретинола-ацетата (витамина A), эргокальциферола (холекальциферола) (витамина D), токоферола-ацетата (витамина E).

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.018-93. Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 12.1.019-79. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств защиты

ГОСТ 1770-74. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4147-74. Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4166-76. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4517-87. Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе

ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80. Посуда и оборудование фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9736-91. Приборы электрические прямого преобразования для измерения неэлектрических величин. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 12026-76. Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80. Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 16317-87. Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 19627-74. Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия

ГОСТ 24104-2001. Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363-80. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28498-90. Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77). Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81). Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 51652-2000. Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия.

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями.

3.1. Содержание витамина A: содержание ретинола-ацетата, определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в международных единицах в 1 кг испытуемой пробы (МЕ/кг). 1 МЕ витамина A соответствует 0,344 мкг ретинола-ацетата.

3.2. Содержание витамина E: содержание токоферола-ацетата, определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в миллиграммах в 1 кг (мг/кг) испытуемой пробы.

3.3. Содержание витамина D: содержание эргокальциферола (витамина ) или холекальциферола (витамина ), определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в международных единицах в 1 кг испытуемой пробы (МЕ/кг). 1 МЕ витамина D соответствует 0,025 мкг эргокальциферола (холекальциферола).

Диапазоны измерений содержания витаминов и характеристики погрешности измерений приведены в таблице 1.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на фотоэлектроколориметр, спектрофотометр и хроматограф.

5.2. Помещение, в котором проводят измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить в вытяжном шкафу.

5.3. При работе с газовыми баллонами необходимо руководствоваться НД [1].

6.1. Отбор проб - по ГОСТ 13496.0.

6.2. Измельчение пробы

6.2.1. Оборудование:

мельница лабораторная электрическая, обеспечивающая измельчение пробы до прохода остатка через сито с отверстиями диаметром 1 мм;

сито с отверстиями диаметром 1 мм.

6.2.2. Из средней пробы исследуемого продукта методом квартования выделяют часть пробы массой не менее 100 г и измельчают на лабораторной мельнице до такого состояния, чтобы весь продукт проходил через сито с отверстиями диаметром 1 мм без остатка. Размолотую пробу тщательно перемешивают.

Сущность метода заключается в омылении образца водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов диэтиловым эфиром, разделении витаминов хроматографией на колонке с окисью алюминия и количественном определении витаминов фотометрическим методом.

7.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Спектрофотометр типа СФ-26, СФ-46 со спектральным диапазоном работы 186 - 1100 нм, основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%, градуировкой длин волн в ультрафиолетовой (УФ) области - не более 0,1 нм.

Фотоэлектроколориметр с пределом измерений оптической плотности от 0 до 2, основной погрешностью измерений не более 1% и светофильтром длиной волны .

Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

Баллон с азотом рабочим давлением от 40 до 60 кг/см2 (от 4 до 6 МПа) [1].

Испаритель ротационный диапазоном измерения рабочего давления от 7 до 760 мм рт. ст. или насос водоструйный по ГОСТ 25336.

Баня водяная с регулятором нагрева.

Термометр жидкостный по ГОСТ 28498.

Печь муфельная электрическая, обеспечивающая поддержание температуры от 0 до 800 °C с погрешностью +/- 10 °C по ГОСТ 9736.

Секундомер [2].

Чашки выпарительные фарфоровые диаметром 123 мм по ГОСТ 9147.

Щипцы для тиглей муфельные.

Лампа ультрафиолетовая со светофильтрами .

Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание температуры от 0 °C до 110 °C с погрешностью +/- 2 °C [3].

Холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336.

Колбы конические со шлифом по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 1(2)-50(100, 200)-2 по ГОСТ 1770.

Воронки делительные вместимостью 250, 500 см3 по ГОСТ 25336.

Цилиндры мерные 1(2, 2а, 3, 4, 4а)-25(100, 250)-2 по ГОСТ 1770.

Воронки для фильтрования ВФ-1-56(75)ХС по ГОСТ 25336.

Пипетки с одной отметкой 1-2-0,5(1,2) по ГОСТ 29169.

Пипетки градуированные 1(2, 3, 5)-1(1а, 2, 2а)-2-0,5(1, 2, 5) по ГОСТ 29227.

Пробирки мерные с притертыми пробками П-1(2)-5(10)-0,1(0,2)ХС по ГОСТ 1770.

Склянки из темного стекла.

Колбы с тубусом вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336.

Колбы круглодонные К-1-100(250)-14/23(19/26) по ГОСТ 25336.

Колонки стеклянные для хроматографии размером 10 x 200 мм.

Эксикатор по ГОСТ 25336, заправленный хлористым кальцием, прокаленным при температуре 250 - 300 °C в течение 2 ч.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026 или фильтры [4].

Вата обезжиренная, готовят по ГОСТ 4517.

Палочки деревянные.

Витамин E фармакопейный [5].

Спирт этиловый абсолютированный [6] или приготовленный по ГОСТ 4517.

Железо хлорное, раствор массовой долей около 0,2% в абсолютированном этиловом спирте.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363, раствор массовой долей 50%.

Натрий сернокислый по ГОСТ 4166, безводный.

Алюминия окись безводная [7].

Эфир петролейный, фракция (40 - 70) °C, не содержащая ненасыщенные и ароматические углеводороды.

Эфир диэтиловый фармакопейный, не содержащий пероксидные соединения (испытание на отсутствие пероксидных соединений - по ГОСТ 4517).

Пирогаллол или гидрохинон по ГОСТ 19627.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652.

o-Фенантролин или , раствор массовой долей около 0,5% в абсолютированном этиловом спирте.

Кислота аскорбиновая [8].

Фенолфталеин [9], спиртовый раствор массовой долей 1%.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1. Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и реактивов, по качеству не ниже вышеуказанных.

2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

7.2. Подготовка к испытанию

7.2.1. Приготовление раствора хлорного железа массовой долей около 0,2% в абсолютированном спирте

Навеску реактива массой 0,2 г растворяют в 99,8 см3 абсолютированного этилового спирта.

Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут.

7.2.2. Приготовление раствора o-фенантролина или массовой долей около 0,5% в абсолютированном этиловом спирте

Навеску реактива массой 0,500 г растворяют в 99,5 см3 абсолютированного этилового спирта.

Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут.

7.2.3. Приготовление безводного сернокислого натрия

Реактив высушивают в сушильном шкафу при температуре (105 +/- 2) °C в течение 3 ч, хранят в склянке с притертой пробкой.

7.2.4. Приготовление окиси алюминия

Реактив прокаливают в муфельной печи при температуре (400 +/- 10) °C в течение 4 ч, охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе. К 97 г реактива добавляют 3 см3 дистиллированной воды и тщательно перемешивают.

После отстаивания в течение не менее 3 ч реактив годен к использованию.

Реактив хранят в склянке с притертой пробкой.

7.2.5. Приготовление раствора массовой концентрации 1 мг/см3

Навеску токоферола-ацетата массой 0,1120 г в расчете на содержание чистого вещества помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см3, добавляют от 100 до 200 мг аскорбиновой кислоты, 50 см3 этилового спирта и 10 см3 раствора гидроокиси калия массовой долей 50%. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают в водяной бане при температуре (85 +/- 2) °C в течение 25 мин. Затем содержимое колбы быстро охлаждают под струей водопроводной воды до комнатной температуры, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, приливают по 50 см3 дистиллированной воды и диэтилового эфира, встряхивают и отстаивают до разделения слоев.

После расслаивания нижний водно-спиртовый слой сливают в коническую колбу, а эфирный слой оставляют в делительной воронке. В коническую колбу приливают 50 см3 диэтилового эфира, встряхивают, отстаивают и после расслаивания верхний эфирный слой присоединяют к эфирному экстракту в делительной воронке, а к водно-спиртовому слою в конической колбе снова приливают 50 см3 диэтилового эфира и проводят экстракцию, как было указано выше. После расслаивания эфирный слой из конической колбы снова присоединяют к экстракту в делительной воронке.

Объединенные эфирные экстракты промывают дистиллированной водой порциями по 30 см3 до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с фенолфталеином. Промытый экстракт переносят в коническую колбу вместимостью 250 см3, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сернокислого натрия (10 - 15 г). После окончания фильтрации сернокислый натрий три раза промывают порциями (по 20 - 30 см3) диэтилового эфира. Эфир отгоняют в водяной бане при температуре не выше 50 °C в токе азота или под вакуумом, используя водоструйный насос или роторный испаритель.

К сухому остатку приливают 10 - 15 см3 абсолютированного этилового спирта, количественно переносят раствор в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем в колбе до метки этим же спиртом и тщательно перемешивают.

7.2.6. Приготовление раствора массовой концентрации 20 мкг/см3

1 см3 раствора массовой концентрации 1 мг/см3 переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят объем в колбе абсолютированным спиртом до метки и тщательно перемешивают.

В полученном растворе проверяют массовую концентрацию и его чистоту, снимая спектр в пределах 260 - 310 нм на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно абсолютированного этилового спирта. Чистый имеет симметричный пик максимумом поглощения при длине волны 292 нм.

Массовую концентрацию в растворе , мкг/см3, вычисляют по формуле

где D - оптическая плотность раствора при длине волны 292 нм;

- коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

- оптическая плотность раствора в абсолютированном этиловом спирте массовой концентрации 1 г в 100 см3 при длине волны 292 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см (для ).

7.2.7. Построение градуировочного графика для определения токоферола-ацетата (витамина E)

В пять мерных пробирок вместимостью по 5 см3 приливают 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 и 4,0 см3 раствора массовой концентрации 20 мкг/см3. В первые четыре пробирки добавляют 3,5; 3,0; 2,0 и 1,0 см3 абсолютированного этилового спирта. Затем в пробирки добавляют по 0,5 см3 раствора o-фенантролина и по 0,5 см3 раствора хлорного железа, перемешивают. Ставят опытную пробу в темное место на 5 мин для развития окраски. По истечении времени измеряют оптические плотности испытуемых растворов в порядке возрастания их концентрации на фотоэлектроколориметре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм при длине волны (520 +/- 25) нм относительно абсолютированного этилового спирта. Одновременно проводят контрольное испытание на реактивы без внесения .

По полученным данным строят градуировочный график, откладывая на оси ординат значения разности оптической плотности испытуемых растворов и контрольного раствора, на оси абсцисс - содержание , мкг/5 см3 (10, 20, 40, 60 и 80 мкг/5 см3).

7.2.8. Приготовление элюирующих растворов

7.2.8.1. Приготовление раствора I

В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 6 см3 диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.

7.2.8.2. Приготовление раствора II

В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 12 см3 диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.

7.2.8.3. Приготовление раствора III

В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 30 см3 диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.

7.3. Проведение испытаний

Из-за высокой чувствительности витаминов к ультрафиолетовому свету и воздуху все процедуры, связанные с анализом, следует завершить в течение одного рабочего дня, избегая воздействия натурального и интенсивного флуоресцентного света.

7.3.1. Омыление и экстракция

Навеску исследуемого продукта массой 4,00 - 5,00 г помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см3, приливают 50 см3 этилового спирта, 10 см3 раствора гидроокиси калия массовой долей 50% и добавляют 40 - 50 мг пирогаллола или гидрохинона (на кончике скальпеля).

Колбу соединяют с обратным холодильником, помещают в водяную баню и нагревают при температуре (85 +/- 2) °C в течение 25 мин, периодически перемешивая содержимое колбы. После этого содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры.

Затем в колбу приливают 20 - 25 см3 дистиллированной воды, 50 см3 диэтилового эфира, перемешивают, жидкую часть сливают в делительную воронку вместимостью 500 см3, сохраняя осадок в колбе. Экстракцию витаминов диэтиловым эфиром проводят трижды по 7.2.5.

При образовании устойчивой эмульсии в делительную воронку добавляют 20 см3 этилового спирта.

В объединенный эфирный экстракт добавляют несколько кристаллов бутилокситолуола и промывают его дистиллированной водой порциями по 100 см3 до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с фенолфталеином. Затем экстракт переносят в круглодонную колбу, пропуская его через бумажный фильтр со слоем безводного сернокислого натрия (30 - 50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают 40 см3 диэтилового эфира. Эфир выпаривают досуха в водяной бане при температуре не выше 50 °C в токе азота или под вакуумом на ротационном испарителе. Сухой остаток растворяют в 4 см3 петролейного эфира.

Примечание. Допускается для экстракции применять петролейный эфир.

7.3.2. Подготовка хроматографической колонки

В нижнюю часть колонки помещают кусочек ваты, затем активированную окись алюминия, уплотняя ее постукиванием по колонке деревянной палочкой до высоты сорбента 7 см. Сверху помещают слой безводного сернокислого натрия высотой 1 см.

В колбу с тубусом вставляют резиновую пробку, через сквозное отверстие которой проходит утонченный конец хроматографической колонки. Через колонку при вакууме, создаваемом с помощью водоструйного насоса, пропускают петролейный эфир до полного смачивания слоя окиси алюминия (около 15 см3).

Промывание колонки проводят со скоростью одна капля в секунду, не допуская при этом высыхания верха колонки и просасывания воздуха.

7.3.3. Хроматографическое разделение ретинола и 

4 см3 раствора экстракта испытуемого продукта, полученного по 7.3.1, помещают в колонку, подготовленную по 7.3.2, не допуская высыхания верха колонки. Промывают колонку 15 см3 элюирующего раствора I. Эту фракцию отбрасывают.

элюируют от 15 до 25 см3 раствора II, контролируя продвижение витамина в УФ свете ( имеет голубоватое свечение).

Элюат количественно переносят в коническую колбу вместимостью 50 см3.

К колонке присоединяют другую колбу с тубусом и элюируют ретинол 30 - 35 см3 раствора III, также контролируя продвижение витамина в УФ-свете (ретинол имеет желто-зеленое свечение). Элюат количественно переносят в коническую колбу вместимостью 50 см3 и выпаривают досуха в водяной бане при температуре не выше 50 °C в токе азота или под вакуумом.

Сухой остаток растворяют в 5 - 50 см3 абсолютированного этилового спирта в зависимости от предполагаемого содержания витамина A.

7.3.4. Оптическую плотность полученного раствора ретинола измеряют на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно абсолютированного этилового спирта.

7.3.5. Проведение цветной реакции с раствором 

Собранный и перенесенный в коническую колбу элюат выпаривают досуха на водяной бане при температуре не выше 50 °C в токе азота или под вакуумом. Остаток растворяют в 10 см3 абсолютированного этилового спирта. Ориентируясь на рецептуру добавки, берут 0,2 - 3,5 см3 раствора и переносят в кювету толщиной поглощающего свет слоя 10 мм или в мерную пробирку вместимостью 5 см3, добавляют соответственно от 3,8 до 0,5 см3 абсолютированного этилового спирта, 0,5 см3 раствора o-фенантролина и 0,5 см3 раствора хлорного железа. Опытную пробу ставят в темное место на 5 мин для развития окраски. По истечении времени измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны (520 +/- 25) нм относительно абсолютированного этилового спирта.

Одновременно проводят контрольное испытание на реактивы без внесения .

7.4. Обработка и оформление результатов

7.4.1. Содержание ретинола-ацетата X, МЕ/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле

где 18,3 - массовая концентрация раствора ретинола в абсолютированном этиловом спирте, имеющего оптическую плотность, равную 1, при длине волны 326 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см, МЕ/см3;

V - объем элюата (5 - 50), см3;

D - оптическая плотность раствора;

- коэффициент пересчета граммов в килограммы;

m - масса навески, г;

1,15 - коэффициент пересчета ретинола в ретинол-ацетат.

7.4.2. Содержание токоферола-ацетата X, мг/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле

где K - масса , найденная по градуировочному графику, мкг;

V - объем раствора элюата (10), см3;

- коэффициенты пересчета микрограммов в миллиграммы и граммов в килограммы;

1,1 - коэффициент пересчета в ацетатную форму;

m - масса навески, г;

- объем раствора, взятый для проведения цветной реакции (0,2 - 3,5), см3.

7.4.3. Результат вычисляют до третьей значащей цифры и округляют до двух значащих цифр.

7.4.4. При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Если расхождение между результатами параллельных определений не превышает допустимое , где , и X - результат первого и второго параллельных определений и их среднеарифметическое значение соответственно, то среднеарифметическое значение принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют.

Если расхождения между параллельными определениями вновь превышают регламентируемые допуски, выясняют и устраняют причины плохой сходимости результатов анализа.

Значения d приведены в таблице 2.

По полученному результату анализа и значению относительной погрешности (таблица 1) рассчитывают абсолютную погрешность по формуле

Результат анализа представляют в виде МЕ/кг или мг/кг при P = 0,95.

Сущность метода заключается в омылении образца водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов диэтиловым эфиром с последующим определением витаминов на жидкостном хроматографе.

При содержании витамина D в испытуемом продукте менее 10 МЕ/г перед проведением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) необходима очистка экстракта на колонке с окисью алюминия по 8.3.2. Анализ проводят из отдельно взятой навески массой 10 г.

8.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы по 7.1 со следующим дополнением.

Хроматограф жидкостный "Милихром" с УФ-детектором со спектральным диапазоном 190 - 360 нм, обеспечивающий одновременное измерение на не менее 3 длинах волн с уровнем шумов не более единиц оптической плотности (е. о. п.).

Колонка аналитическая хроматографическая для ВЭЖХ, размером 80 (64, 120) x 2 мм, заполненная сорбентом Силасорб 600 (размер частиц 5 мкм) с эффективностью не ниже 5000 теоретических тарелок.

Прибор для перегонки при атмосферном давлении [10].

Ретинол-ацетат (витамин A) фармакопейный [11].

Эргокальциферол кристаллический (витамин ) [12] или холекальциферол кристаллический (витамин ) [13].

Спирт изопропиловый [14].

Гексан [15].

Алюминия окись для хроматографии [16].

2,6-Ди-трет-бутил-п-крезол (бутиолокситолуол) [17].

Примечание. Допускается применение других типов хроматографов, сорбентов и соответствующих им растворителей, обеспечивающих эффективное разделение исследуемых компонентов. При этом условия разделения витаминов подбираются самостоятельно каждым пользователем.

8.2. Подготовка к испытанию

8.2.1. Приготовление элюирующего раствора

Готовят смесь гексана с изопропиловым спиртом в объемном соотношении 98,5:1,5 (98:2).

8.2.2. Очистка изопропилового спирта

Изопропиловый спирт перегоняют над гидроокисью калия или натрия (10 г гидроокиси требуется для перегонки 1 дм3 спирта).

Реактив должен иметь оптическую плотность не более 0,1 е. о. п. при относительно дистиллированной воды.

8.2.3. Приготовление окиси алюминия

Реактив прокаливают в муфельной печи при температуре (750 +/- 10) °C в течение 4 ч, охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе. К 91 г реактива добавляют 9 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и хранят в посуде с притертой пробкой.

Годен для использования после отстаивания в течение 3 ч.

8.2.4. Приготовление безводного сернокислого натрия - по 7.2.3.

8.2.5. Приготовление растворов ретинола

8.2.5.1. Приготовление раствора ретинола массовой концентрации 1000 МЕ/см3

Навеску ретинола-ацетата, соответствующую 50000 МЕ препарата, помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 см3, добавляют около 200 мг пирогаллола или гидрохинона (на кончике скальпеля), 30 см3 этилового спирта и 5 см3 раствора гидроокиси калия массовой долей 50%. Колбу соединяют с обратным холодильником и проводят омыление в водяной бане при температуре (85 +/- 2) °C в течение 30 мин, охлаждают до комнатной температуры под струей водопроводной воды и добавляют 15 см3 дистиллированной воды. Затем содержимое колбы переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, промывают колбу 20 см3 этилового спирта, который тоже переносят в делительную воронку. Добавляют 30 см3 смеси диэтилового эфира и гексана в объемном соотношении 1:1, полученную смесь тщательно перемешивают. После расслаивания нижний слой (водно-спиртовый) сливают в коническую колбу, а гексано-эфирный оставляют в делительной воронке. Эту операцию экстракции ретинола гексано-эфирной смесью из водно-спиртового слоя в конической колбе проводят еще дважды по 7.2.5, каждый раз сливая в делительную воронку гексано-эфирный слой. Объединенный экстракт в делительной воронке промывают дистиллированной водой порциями по 30 см3 до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с раствором фенолфталеина. Промытый экстракт переносят в коническую колбу вместимостью 250 см3, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сернокислого натрия (40 - 50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают дважды порциями гексано-эфирной смеси (20 - 30 см3). Экстракт выпаривают досуха в водяной бане при температуре не выше 60 °C в токе азота или под вакуумом на ротационном испарителе. Сухой остаток растворяют в гексане, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавляют 100 мг бутилокситолуола, перемешивают, объем раствора в колбе доводят гексаном до метки и снова тщательно перемешивают.

8.2.5.2. Приготовление градуировочных растворов ретинола массовой концентрации 20, 100 и 500 МЕ/см3

В три мерные колбы вместимостью по 50 см3 помещают 1; 5 и 25 см3 раствора ретинола массовой концентрации 1000 МЕ/см3, доводят объемы растворов в колбах до метки гексаном и тщательно перемешивают.

Оптическую плотность растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно гексана.

Массовую концентрацию ретинола в растворе , МЕ/см3, вычисляют по формуле

где D - оптическая плотность раствора ретинола;

- коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

- оптическая плотность раствора ретинола в гексане массовой концентрации 1 г в 100 см3 при длине волны 326 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см (для ретинола );

0,3 - коэффициент пересчета массы ретинола в МЕ, мкг/МЕ.

8.2.6. Приготовление растворов 

8.2.6.1. Приготовление раствора массовой концентрации 1000 мкг/см3

Навеску витамина E массой 0,1120 г в расчете на содержание чистого вещества помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см3 и проводят омыление, экстракцию и обезвоживание по 7.2.5.

После выпаривания сухой остаток растворяют в 100 см3 гексана.

8.2.6.2. Приготовление градуировочных растворов массовой концентрации 20, 100 и 500 мкг/см3

В три мерные колбы вместимостью 50 см3 помещают 1; 5 и 25 см3 раствора массовой концентрации 1000 мкг/см3, доводят объем раствора в колбах до метки гексаном и тщательно перемешивают.

Массовые концентрации в растворах проверяют спектрофотометрически по 7.2.6 и вычисляют по формуле 1.

8.2.7. Приготовление растворов витамина D

8.2.7.1. Приготовление раствора витамина D массовой концентрации 20000 МЕ/см3

Навеску кристаллического эргокальциферола (холекальциферола) массой 0,100 г помещают в мерную колбу вместимостью 200 см3, растворяют в гексане, объем раствора в колбе доводят до метки гексаном и тщательно перемешивают.

8.2.7.2. Приготовление градуировочных растворов витамина D массовой концентрации 50 и 100 МЕ/см3

В две мерные колбы вместимостью 200 см3 помещают 0,5 и 1,0 см3 раствора витамина D массовой концентрации 20000 МЕ/см3. Объемы растворов в колбах доводят до метки гексаном и тщательно перемешивают.

Оптическую плотность растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 265 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно гексана.

Массовую концентрацию витамина D в растворе , МЕ/см3, вычисляют по формуле

где D - оптическая плотность раствора витамина D;

- коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

- оптическая плотность раствора витамина D в гексане массовой концентрации 1 г в 100 см3 раствора при длине волны 265 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см (для витамина ; для витамина );

0,025 - коэффициент пересчета массы витамина D в МЕ, мкг/МЕ.

8.2.8. В растворы витаминов добавляют несколько кристаллов 2,6-ди-трет-бутил-п-крезола (бутиолокситолуола) и хранят в холодильнике не более 1 мес.

8.3. Проведение испытания

8.3.1. Омыление и экстракция

Навеску исследуемого продукта массой 5,00 - 10,00 г помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см3, добавляют 100 - 150 мг пирогаллола или гидрохинона (на кончике скальпеля) и соответственно 50 - 70 см3 этилового спирта и 10 - 15 см3 раствора гидроокиси калия массовой долей 50%. Дальнейшую процедуру омыления и экстракции проводят по 7.3.1. Сухой остаток витаминов растворяют в 4 см3 гексана.

Примечание. Допускается для экстракции применять петролейный эфир.

8.3.2. Очистка раствора, полученного по 8.3.1, на колонке с окисью алюминия

8.3.2.1. Подготовка хроматографической колонки - по 7.3.2.

8.3.2.2. Элюирование витамина D

В колонку (8.3.2.1), не допуская высыхания верха колонки, вносят 4 см3 раствора (8.3.1) и промывают ее 20 см3 петролейного эфира и 4 см3 смеси петролейного и диэтилового эфира в объемном соотношении 1:1. Эту фракцию отбрасывают.

Витамин D элюируют 20 см3 смеси петролейного и диэтилового эфира в объемном соотношении 1:1. Элюат количественно переносят в коническую колбу вместимостью 50 см3 и выпаривают досуха в водяной бане под током азота при температуре (60 +/- 2) °C.

Сухой остаток растворяют в 1 см3 гексана.

Полученный раствор (далее испытуемый раствор) используют для ВЭЖХ.

8.3.3. Подготовка жидкостного хроматографа к работе

Подготовку прибора осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Перед началом работы колонку промывают элюентом при скорости его подачи 100 - 200 мкдм3/мин в течение 5 - 10 мин.

8.3.4. Выполнение измерений на хроматографе "Милихром"

8.3.4.1. Условия проведения измерений

Измерения проводят в следующих условиях:

а) разделение компонентов проводят на колонке размером 64 (80, 120) x 2 мм;

б) сорбент - Силосорб 600;

в) элюент - гексан-изопропиловый спирт в объемном соотношении 98,5:1,5 (98:2);

г) рабочие длины волн УФ-детектора - 264, 292 и 324 нм (соответственно для витаминов D, E, A);

д) скорость элюирования - 150 - 200 мкдм3/мин;

е) объем анализируемого раствора - 10 - 40 мкдм3 для витамина D и 4 - 5 мкдм3 для витаминов A, E.

8.3.4.2. Проведение измерений испытуемого раствора

Для измерений используют метод внешнего стандарта. В колонку хроматографа последовательно вводят равные объемы испытуемого и градуировочного растворов.

В качестве градуировочного выбирают раствор, высота пика которого наименее отличается от высоты пика испытуемого раствора.

Концентрация градуировочных растворов должна уточняться в день их использования по 8.2.5.2, 8.2.6.2 и 8.2.7.2.

Пик витамина на хроматограмме испытуемого раствора идентифицируют по времени удерживания.

Примеры хроматограмм экстрактов витаминов A, D, E из белково-витаминно-минеральных добавок представлены в Приложении А.

8.4. Обработка результатов

8.4.1. Содержание витаминов X, витамина A - МЕ/кг, витамина E - мг/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле

где c - концентрация используемых градуировочных растворов, МЕ/см3 (ретинол), мг/см3 ;

- среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика испытуемого раствора для двух параллельных определений анализируемого компонента, мм или е. о. п.;

V - объем разведения, см3 (4 см3);

- коэффициент пересчета граммов в килограммы;

- коэффициент пересчета в ацетатную форму (для витамина A , для витамина E );

- среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика градуировочного раствора для двух параллельных определений анализируемого компонента, мм или е. о. п.;

m - масса навески испытуемой пробы, г.

Примечание. При расчете содержания витамина A высоты (площади) пиков испытуемого и градуировочного растворов рассчитывают как сумму высот (площадей) цис- и транс-формы ретинола.

8.4.2. Содержание витамина D X, МЕ/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле

где c - концентрация используемого градуировочного раствора, МЕ/см3;

- среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика испытуемого раствора для двух параллельных анализов, мм или е. о. п.;

V - объем разведения, см3 (4 см3);

- коэффициент пересчета граммов в килограммы;

1,15 - коэффициент, учитывающий превращение витамина D в провитамин;

- среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика градуировочного раствора для двух параллельных анализов, мм или е. о. п;

m - масса навески испытуемой пробы, г.

При определении витамина D, если в качестве градуировочного вещества используют эргокальциферол (витамин ), то числитель в формуле дополнительно умножают на коэффициент 0,97.

8.4.3. Результаты вычисляют до третьей значащей цифры и округляют до двух значащих цифр.

8.4.4. Контроль сходимости результатов параллельных определений и представление результатов по 7.4.4.

9.1. Контроль сходимости результатов параллельных определений - по 7.4.4.

9.2. Для контроля воспроизводимости используют рабочие пробы. Каждую пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой настоящего стандарта, получают два результата испытаний в разных лабораториях или в одной, но выполненные разными исполнителями на разном оборудовании с использованием реактивов разных партий в разное время. Воспроизводимость считают удовлетворительной, если , где , и - результаты испытаний одной и той же пробы, полученные в двух разных лабораториях или в разных условиях в одной лаборатории, и их среднеарифметическое значение. Значение D приведено в таблице 2.

9.3. Контроль точности выполняют методом добавок. Рабочую пробу делят на две равные части, первую из которых анализируют в соответствии с методикой, а во вторую вводят известную добавку витамина и затем анализируют в соответствии с методикой настоящего стандарта. Значение добавки должно составлять 50% - 150% содержания витамина в испытуемой пробе. Точность контрольных испытаний признают удовлетворительной, если , где , и C - результаты контрольных испытаний пробы с добавкой, без добавки и значение добавки. Значение норматива K для вероятности P = 0,90 вычисляют по формуле

где и - значения погрешности результатов анализа пробы без добавки и пробы с добавкой, вычисленные по 7.4.4.

Пример - Проведен анализ пробы с добавкой и без добавки (X = 30 МЕ/кг) на содержание витамина A. Значение добавки составляет C = 20 МЕ/кг, значение относительной погрешности . Результат контрольного анализа равен:

Норматив контроля точности находят по формуле

Анализ выполнен с достаточной точностью, так как результат контрольного анализа меньше норматива контроля точности (10 < 10,5).