"ГОСТ Р 54085-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Shigella"
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 30.11.2010 N 745-ст)

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 года N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".

1. Разработан Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" (ГНУ ВНИИКОП).

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытания агропромышленной продукции на безопасность".

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2010 г. N 745-ст.

4. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной массе или объеме пищевого продукта бактерий рода Shigella.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 7218-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella

ГОСТ Р 54004-2010 Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29228-91 (ИСО 835-2-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, а также по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1. Бактерии рода Shigella: Грамотрицательные, факультативно-анаэробные бактерии, которые на агаризованных селективно-диагностических средах образуют типичные колонии. Описание и методы определения биохимических и серологических характеристик этих микроорганизмов приведены в настоящем стандарте.

3.2. Выявление бактерий рода Shigella: Определение присутствия или отсутствия бактерий рода Shigella в определенной массе или объеме пищевого продукта в соответствии с настоящим стандартом.

4.1. Общие положения

Метод выявления бактерий рода Shigella в определенной массе или объеме пищевого продукта состоит из следующих этапов: высев определенного количества продукта в жидкую неселективную среду, инкубирование посевов, последующее выявление в этих посевах бактерий, способных развиваться в жидкой селективной среде, образующих типичные колонии на агаризованных селективно-диагностических средах, имеющих типичные для бактерий рода Shigella биохимические и серологические характеристики.

4.2. Предварительное обогащение в неселективной жидкой среде

Бактерии рода Shigella могут присутствовать в пищевом продукте в небольшом количестве вместе с большим количеством других бактерий из семейства Enterobacteriaceae или других семейств. Поэтому предварительное обогащение необходимо для выявления небольшого числа клеток бактерий рода Shigella или сублетально поврежденных клеток бактерий рода Shigella.

Для предварительного неселективного обогащения используют забуференную пептонную воду, для некоторых пищевых продуктов используют другое предварительное обогащение по 8.1.2.

Забуференную пептонную воду инокулируют при комнатной температуре пробой пищевого продукта для анализа, затем посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (18 +/- 2) ч.

Для большего эффекта перед внесением анализируемой пробы продукта забуференную пептонную воду нагревают до температуры (37 +/- 1) °C, то есть до температуры инкубирования посевов.

4.3. Обогащение в селективной жидкой среде

Бульон для бактерий рода Shigella сначала инокулируют культурой, полученной по 4.2, а затем инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

4.4. Выделение чистой культуры

Культуры, полученные по 4.3, пересевают на две агаризованные селективно-диагностические среды:

- ксилоза лизин дезоксихолатный агар (XLD агар) и на одну из агаризованных сред - гектоеновый энтероагар, сальмонелла-шигелла агар, висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или дезоксихолатный цитратный агар.

Посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C и по окончании (24 +/- 2) ч посевы просматривают.

Арбитражной средой является ксилоза лизин дезоксихолатный агар (XLD агар).

4.5. Проведение идентификации

По биохимическим и серологическим тестам подтверждают принадлежность бактерий из колоний, выросших на чашках Петри по 4.4, к бактериям рода Shigella.

5.1. Общие положения

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и реактивов, должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а., а вода должна быть дистиллированной.

5.2. Питательные среды, растворы реактивов

5.2.1. Среда для неселективного предварительного обогащения: вода пептонная забуференная - Приложение А (А.1).

5.2.2. Среда обогатительная селективная: бульон для бактерий рода Shigella - Приложение А (А.2).

5.2.3. Среды агаризованные селективно-диагностические

5.2.3.1. Первая среда: агар ксилоза лизин дезоксихолатный (XLD агар) - Приложение А (А.3.1).

5.2.3.2. Вторая среда - Приложение А (А.3.2).

5.2.4. Агар питательный или ГРМ-агар - Приложение А (А.4).

5.2.5. Агар мясо-пептонный - Приложение А (А.5).

5.2.6. Бульон мясо-пептонный с глюкозой - Приложение А (А.6).

5.2.7. Среды с углеводами (Среды Гисса) - Приложение А (А.7).

5.2.8. Агар трехсахарный железистый (TSI агар) или агар Клиглера, или агар Олькеницкого - Приложение А (А.8).

5.2.9. Агар с мочевиной (Кристенсена) - Приложение А (А.9).

5.2.10. Среда для определения L-лизин декарбоксилазы - Приложение А (А.10).

5.2.11. Среда для Фогес-Проскауера (VP) реакции - Приложение А (А.11).

5.2.12. Реактив для Фогес-Проскауера (VP) реакции - Приложение А (А.12).

5.2.13. Среда Козера - Приложение А (А.13).

5.2.14. Среда Симмонса - Приложение А (А.14).

5.2.15. Агар дезоксихолатный цитратный - Приложение А (А.15).

5.2.16. Энтероагар гектоеновый - Приложение А (А.16).

5.2.17. Агар питательный полужидкий - Приложение А (А.17).

5.2.18. Агар мясо-пептонный полужидкий - Приложение А (А.18).

5.2.19. Раствор физиологический - Приложение А (А.19).

5.3. Сыворотки

5.3.1. Сыворотки диагностические шигеллезные агглютинирующие адсорбированные поливалентные сухие к Shigella dysenteriae 1, 2; 3 - 7; 8 - 12.

5.3.2. Сыворотки диагностические шигеллезные агглютинирующие адсорбированные поливалентные сухие к Shigella boydii 1, 2, 4, 5, 7, 9, 12; 3, 6, 8, 10, 11; 13, 14, 15.

5.3.3. Сыворотки диагностические шигеллезные агглютинирующие адсорбированные поливалентные сухие к Shigella flexneri I - V.

5.3.4. Сыворотки диагностические шигеллезные агглютинирующие адсорбированные поливалентные сухие к Shigella flexneri I - VI и Shigella sonnei.

5.3.5. Для идентификации бактерий рода Shigella используют постановку реакции агглютинации с диагностическими шигеллезными агглютинирующими адсорбированными поливалентными сыворотками.

Адсорбированные сыворотки содержат антитела, которые агглютинируют взвеси культур шигелл, содержащие соответствующие антигены.

Каждое опытное определение должно быть гарантированным, то есть используемая сыворотка должна быть пригодной для агглютинации бактерий рода Shigella.

Качество сывороток проверяется в реакции с контрольными штаммами бактерий рода Shigella.

5.3.6. Сухие агглютинирующие адсорбированные сыворотки промышленного производства готовят перед употреблением в соответствии с рекомендациями, указанными в прилагаемых к ним инструкциях.

Приемлемой альтернативой посуде многоразового применения является одноразовая посуда, если она отвечает соответствующим требованиям.

6.1. Оборудование лабораторное для микробиологических исследований - по ГОСТ Р ИСО 7218, ГОСТ 10444.1.

6.2. Аппарат для сухой стерилизации (стерилизационный сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав), с регулирующими устройствами для поддержания заданной температуры, с допустимой погрешностью не более +/- 1 °C.

6.3. Термостат, поддерживающий температуру (37 +/- 1) °C.

6.4. Баня водяная, поддерживающая заданную температуру от 44 °C до 47 °C с погрешностью +/- 0,5 °C.

6.5. Прибор для мембранной фильтрации растворов.

6.6. Весы лабораторные для взвешивания реактивов с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания +/- 0,01 мг и +/- 10 мг.

6.7. Пробирки и колбы разной вместимости по ГОСТ 25336. Допускается использование флаконов или бутылок с нетоксичными металлическими или пластиковыми завинчивающимися крышками.

6.8. Микроскоп биологический, обеспечивающий просмотр в проходящем свете, с увеличением .

6.9. Петля бактериологическая, с размером диаметра петли около 3 мм.

6.10. pH-метр с диапазоном измерений pH от 2 до 18, погрешность измерений +/- 0,01 ед. pH при температуре 20 °C - 25 °C.

6.11. Стекла предметные по ГОСТ 9284.

6.12. Стекла покровные по ГОСТ 6672.

6.13. Пипетки градуированные или автоматические, вместимостью от 1 до 10 см3 по ГОСТ 29228.

6.14. Чашки Петри нормального размера (диаметр 100 мм) и/или большого размера (диаметр 150 мм) по ГОСТ 25336.

6.15. Натрий дезоксихолат.

6.16. Аммоний железо III цитрат.

6.17. Карбамид (мочевина) по ГОСТ 6691.

6.18. Контрольные штаммы бактерий рода Shigella.

6.19. Креатина моногидрат.

6.20. Ксилоза.

6.21. L-лизин моногидрохлорид.

6.22. Экстракт мясной.

6.23. Настой сердца (порошок).

6.24. Новобиоцин натриевая соль.

6.25. Пептический перевар животных тканей.

6.26. Протеозопептон.

6.27. Твин-80.

6.28. Феноловый красный.

6.29. Гидролизат казеина ферментативный.

6.30. Железа III цитрата тригидрат.

6.31. Цитрат натрия.

6.32. Спирт этиловый пищевой 96%-ный по ГОСТ Р 51652.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов по качеству не хуже указанных в разделе 6.

Отбор и подготовка проб - по ГОСТ Р 54004, ГОСТ 26669.

Для анализа отбирают лабораторную пробу, не поврежденную и не измененную по качеству в ходе транспортировки или хранения.

В соответствии с Приложением Б (рисунок Б.1).

8.1. Проба для анализа и исходное разведение

8.1.1. Общие положения

Для приготовления исходного разведения в основном используют как разбавитель неселективную среду, указанную в 5.2.1 и 4.2 (забуференную пептонную воду).

Если масса (объем) пробы для анализа другая, чем 25 г, то используют необходимый объем неселективной среды исходя из соотношения массы (объема) анализируемого продукта и объема неселективной среды 1:10.

Допускается объединение проб для анализа в том случае, если анализируется больше одной пробы от продукта и когда объединенная проба не влияет на результат испытания. (Например, необходимо проанализировать 10 проб по 25 г. Объединяют 10 проб продукта (общая масса составит 250 г) и прибавляют 2,25 дм3 неселективной среды).

8.1.2. Специфика приготовления исходного разведения для некоторых продуктов

Указанную специфику приготовления применяют только для выявления бактерий рода Shigella.

8.1.2.1. Какао и какаосодержащие продукты (какао больше, чем 20%)

Добавляют в забуференную пептонную воду (по 5.2.1) 100 г обезжиренного молочного порошка или 50 г казеина (кислый казеин не используют). Казеин и молочный порошок добавляют при приготовлении забуференной пептонной воды до стерилизации.

8.1.2.2. Высококислотные пищевые продукты

При неселективном обогащении должна быть гарантия того, что pH посевов будет не менее 5,0.

pH высококислотных пищевых продуктов стабилизируют путем использования забуференной пептонной воды двойной концентрации.

Допускается при высеве жидких высококислотных пищевых продуктов, для предотвращения снижения pH сред на 0,5 и более, pH продукта перед посевом доводить до (7,0 +/- 0,2).

При высеве твердых высококислотных пищевых продуктов допускается доводить pH до (7,0 +/- 0,2) в посевах.

Доведение pH продукта проводят с соблюдением правил асептики с помощью стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Количество добавляемых растворов устанавливают опытным путем.

8.2. Неселективное обогащение

Посев в забуференную пептонную воду по 8.1.1 инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (18 +/- 2) ч.

8.3. Селективное обогащение

Культуры, полученные после инкубирования по 8.2, пересевают в среду для селективного обогащения. Для этого по 1 см3 культуральной жидкости пересевают в 10 см3 бульона для бактерий рода Shigella.

Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

Если от одного пищевого продукта проведен высев нескольких проб продукта для анализа (каждой пробы отдельно) для выявления бактерий рода Shigella, то допускается из каждого посева по 8.2 проводить пересев в один флакон с бульоном для шигелл. При этом количество селективной среды во флаконе должно быть увеличено по сравнению с 10 см3 во столько раз, из скольких посевов проводят пересев.

Свежие продукты, не содержащие сублетально поврежденных микроорганизмов, подвергнутых каким-либо воздействиям, например сушке, заморозке и т.д., допускается высевать непосредственно в селективную среду, минуя этап неселективного обогащения. Объемы высеваемого продукта и среды должны быть в соотношении не менее 1:10.

8.4. Выделение чистой культуры

8.4.1. Культуры после 24 ч инкубирования на селективной среде пересевают так, чтобы получить хорошо изолированные колонии на ксилоза лизин дезоксихолатный агар (XLD агар) и на одну из агаризованных сред: гектоеновый энтероагар, сальмонелла-шигелла агар, висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или дезоксихолатный цитратный агар.

При отсутствии чашек большого размера по 6.14 используют для пересева петлей две чашки нормального размера по 6.14 (одну за другой). Пересев проводят в соответствии с требованиями Приложения В.

На ксилозализин дезоксихолатном агаре проводят учет ферментации лактозы, сахарозы, ксилозы, декарбоксилирование лизина, образование сероводорода.

Бактерии рода Shigella не ферментируют лактозу, сахарозу, ксилозу, не декарбоксилируют лизин и не образуют сероводород.

На гектоеновом энтероагаре проводят учет ферментации лактозы, сахарозы, салицина и образование сероводорода.

Бактерии рода Shigella не ферментируют салицин.

На сальмонелла-шигелла агаре проводят учет ферментации лактозы и образование сероводорода.

На дезоксихолатном цитратном агаре, среде Плоскирева, среде Эндо, среде Левина проводят учет ферментации лактозы.

На висмут-сульфитном агаре проводят учет ферментации глюкозы и обнаружение сульфитредуцирующих свойств.

Бактерии рода Shigella не обладают сульфитредуцирующими свойствами.

8.4.2. Посевы на чашках Петри по 8.4.1 переворачивают на крышку дном вверх и помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C и инкубируют в течение (24 +/- 2) ч.

8.4.3. После инкубации просматривают чашки с посевами и отмечают присутствие типичных для бактерий рода Shigella колоний и атипичных колоний, которые могут быть отнесены к бактериям рода Shigella. Отмечают их местоположение на дне чашек.

Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на XLD агаре, имеют красный цвет, который принадлежит цвету индикатора.

Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на гектоеновом энтероагаре, имеют зеленый или голубоватый цвет.

Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на дезоксихолатном цитратном агаре, на сальмонелла-шигелла агаре, на средах Эндо, Плоскирева, Левина, круглые бесцветные или слегка розоватые.

Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на висмут-сульфитном агаре, имеют серо-зеленый цвет.

При отсутствии в посевах на селективно-диагностических средах типичных для бактерий рода Shigella колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Shigella в анализируемой пробе продукта.

При наличии хотя бы на одной селективно-диагностической среде типичных колоний проводят подтверждение принадлежности их к бактериям рода Shigella.

8.5. Подтверждение принадлежности выделенных бактерий к роду Shigella

8.5.1. Общие положения

Для определения биохимических характеристик выделенных бактерий допускается использование идентификационных наборов. Эти наборы используют в соответствии с инструкцией.

Для биохимической идентификации допускается использование тест-систем промышленного производства, разрешенных к применению в установленном порядке.

8.5.2. Отбор колоний для подтверждения

Для подтверждения берут с посева в чашку Петри по 8.4.1 (две чашки нормального размера считают за одну) каждой селективной среды (8.4) сначала одну типичную колонию и затем четыре колонии, если первая окажется отрицательной.

Для идентификации в случае эпидемиологической ситуации одновременно отбирают пять колоний. Если на одной чашке меньше пяти типичных колоний, то отбирают все типичные колонии.

Переносят отобранные колонии на скошенную поверхность питательного или ГРМ-агара в чашках или пробирках (5.2.4) или мясо-пептонного агара (5.2.5), для идентификации отбирают полностью изолированные колонии. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

Для биохимической и серологической идентификации используют чистые культуры бактерий.

Из отобранных для биохимической идентификации колоний приготовляют мазки и окрашивают по Граму по ГОСТ 30425.

Бактерии рода Shigella являются грамотрицательными прямыми палочками.

Допускается окраску по Граму заменять тестом Грегорсена. Для этого на предметном стекле в капле 3%-ного водного раствора калия гидроокиси эмульгируют культуру микроорганизмов, взятую из колонии с агаризованной среды. Если через несколько секунд взвесь ослизнет и за петлей потянутся слизистые нити, то это указывает на принадлежность анализируемой культуры к грамотрицательному виду бактерий. У грамположительных бактерий слизистых нитей не образуется.

8.5.3. Биохимическое подтверждение

У отобранных и предварительно пересеянных культур изучают характер роста на TSI агаре, или агаре Клиглера, или среде Олькеницкого возможность расщепления мочевины, образования ацетоина, утилизации цитрата, наличие L-лизин декарбоксилазы и подвижность.

8.5.3.1. Общие положения

Петлей инокулируют специфические среды с 8.5.3.2 по 8.5.3.7 каждой культурой, полученной из колоний по 8.5.2.

8.5.3.2. TSI агар (5.2.8), среда Олькеницкого или агар Клиглера

Засевают штрихом скошенную поверхность агара и уколом - столбик. Инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

Интерпретация изменений в среде

а) Столбик

б) Скошенная поверхность

Типичные культуры бактерий рода Shigella показывают щелочную (красную) скошенную поверхность и кислый (желтый) столбик без образования газа (пузырьков), сероводород (черный агар) не образуется.

Отношение выделенных культур к бактериям рода Shigella не может основываться только на результатах теста на TSI агаре или агаре Клиглера, или среде Олькеницкого.

Дальнейшему испытанию подвергаются бактерии, показавшие типичные характеристики на TSI агаре или на агаре Клиглера, или среде Олькеницкого.

При снятии результатов роста выявленных бактерий на трехсахарном агаре (агаре Клиглера, среде Олькеницкого) учитывают типичный рост для бактерий рода Salmonella, руководствуясь требованиями ГОСТ 52814. Если подобный рост бактерий обнаружен, то дальнейшее испытание проводят с учетом возможного присутствия бактерий рода Salmonella.

8.5.3.3. Агар с мочевиной (агар Кристенсена) (5.2.9)

Культуры пересевают штрихом на поверхность агара Кристенсена с мочевиной. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч, наблюдая за посевами через определенные промежутки времени.

При положительной реакции, расщеплении мочевины с выделением аммония, цвет фенолового красного изменяется от розового до сильного светло-вишневого.

Для уреазоположительных бактерий реакция в основном становится видимой после 2 ч инкубирования.

Бактерии рода Shigella мочевину не расщепляют.

8.5.3.4. Определение L-лизин декарбоксилазы (5.2.10)

Инокулируют снизу жидкую среду для определения L-лизин декарбоксилазы (5.2.10). Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

Помутнение и пурпуровый цвет после инкубации указывают на положительную реакцию. Желтый цвет указывает на отрицательную реакцию.

Бактерии рода Shigella не обладают L-лизин декарбоксилазой (реакция отрицательная).

8.5.3.5. Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера) (5.2.11)

Анализируемую культуру суспензируют петлей в стерильной пробирке, содержащей 3 см3 VP среды (5.2.11) или мясо-пептонного бульона с глюкозой (5.2.6).

Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

После инкубации к посеву прибавляют две капли раствора креатина, три капли спиртового раствора 1-нафтола и две капли раствора гидроокиси калия, содержимое пробирки перемешивают после прибавления каждого реактива.

Образование от розового до светло-красного цвета после 15 мин указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Shigella не образуют ацетоин (реакция Фогес-Проскауера отрицательная).

Допускается определение ацетоина проводить без применения раствора креатина. Для этого после инкубирования к 1 см3 отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см3 раствора 1-нафтола и 0,2 см3 раствора гидроокиси калия, содержимое пробирки перемешивают после прибавления каждого реактива.

Появление розового окрашивания через 15 мин указывает на положительную реакцию.

8.5.3.6. Определение подвижности

Культуры пересевают уколом в полужидкий питательный агар (5.2.17) или полужидкий мясо-пептонный агар (5.2.18).

Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

При росте подвижных культур отмечается диффузионный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных культур - вдоль места укола.

Бактерии рода Shigella неподвижны.

8.5.3.7. Определение утилизации цитрата

Культуру высевают в пробирки со средой Козера (5.2.13) или на поверхность среды Симмонса (5.2.14). Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч. Изменение оливково-зеленого цвета сред на васильковый (или синий) указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Shigella не утилизируют цитрат.

8.5.3.7. Интерпретация биохимических тестов приведена в таблице Г.1 Приложения Г.

8.5.4. Серологическое подтверждение

8.5.4.1. Общие положения

Определение присутствия антигенов у изучаемых культур (8.5.2) проводят путем постановки реакции агглютинации на предметном стекле с соответствующими сыворотками после исключения самоагглютинирующих штаммов. Сыворотки используют в соответствии с инструкцией изготовителя, если есть отличие от описания, приведенного ниже.

Серологическое подтверждение принадлежности к бактериям рода Shigella проводят с культурами, предварительно пересеянными на поверхность питательного агара, мясо-пептонного агара или ГРМ-агара.

8.5.4.2. Исключение самоагглютинирующих штаммов

Помещают каплю физиологического раствора на тщательно очищенное предметное стекло. Диспергируют в этой капле часть тестируемой колонии так, чтобы получилась гомогенная и густая суспензия.

Допускается размешивание части колонии в капле воды и перемешивании этого раствора с одной каплей физиологического раствора.

Стекло осторожно покачивают в течение 30 - 60 с. Отмечают результаты на темном фоне, лучше с помощью увеличительного стекла. Если наблюдается в разной степени склеивание бактерий, то есть образование осадка, то считают, что тестируемая культура бактерий обладает самоагглютинацией.

Штаммы бактерий, обладающие самоагглютинацией, не подвергают дальнейшему серологическому испытанию.

8.5.4.3. Определение наличия антигенов

Культуры бактерий, у которых не выявлено самоагглютинации, испытывают в реакции агглютинации с агглютинирующими адсорбированными поливалентными шигеллезными сыворотками.

Подготовка сывороток к постановке реакции агглютинации и методика ее проведения указаны в инструкциях, прилагаемых к сывороткам.

Агглютинация (наличие O-антигенов) проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.

При отрицательной реакции агглютинации культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную смесь.

Используют поливалентные сыворотки, одну после другой.

8.5.5. Интерпретация биохимических и серологических тестов

Интерпретация подтверждающих тестов (8.5.3 и 8.5.4) для испытанных культур бактерий (8.5.2) представлена в таблице 1.

При определении биохимических и серологических тестов выделенных культур в качестве контроля используют типичные по этим показателям штаммы бактерий рода Shigella, указанные в разделе 6.

Культуры, предположительно отнесенные к бактериям рода Shigella, передают в компетентные аккредитованные центры по изучению этих бактерий для окончательного их типирования. Культуру при этом сопровождают всей полученной информацией с указанием наименования продукта, из которого выделен штамм.

В этом случае результаты выявления бактерий рода Shigella выдают после получения ответа по окончательному их типированию.

9.1. Результаты оформляют по каждой лабораторной пробе отдельно.

9.2. Результаты выявления бактерий рода Shigella в определенной массе или объеме продукта записывают: "Бактерии рода Shigella обнаружены (не обнаружены) в X г (см3) пищевого продукта".

X - масса (объем) анализируемой пробы пищевого продукта, в которой выявляли бактерии рода Shigella, г (см3).

Протокол испытания должен включать следующее:

- используемый метод отбора проб;

- использование каких-нибудь отклонений в методе обогащения или инкубации;

- все условия испытания, не включенные в настоящий стандарт, а также причины, которые могут влиять на результаты;

- полученные результаты.

Требования безопасности выполнения работ и квалификации оператора - по ГОСТ Р ИСО 7218, [1].

А.1. Вода пептонная забуференная

А.1.1. Состав

А.1.2. Приготовление

При нагревании растворяют компоненты в воде. Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Разливают среду во флаконы подходящей вместимости с учетом добавления необходимой массы (объема) пробы пищевого продукта (если масса равна 25 г, то разливают по 225 см3, то есть в соотношении 1:10). Стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

А.2. Среда обогатительная селективная: бульон для бактерий рода Shigella

А.2.1. Основа среды

При нагревании и частом помешивании растворяют в 1 дм3 воды дегидратированные компоненты или 31,5 г дегидратированной основы.

Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Разливают среду во флаконы. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин, охлаждают до 45 - 50 °C и с соблюдением правил асептики добавляют на 1 дм3 среды 5 см3 раствора селективной добавки, приготовленной по А.2.2. Тщательно перемешивают и мерно разливают в стерильную посуду (флаконы или колбы, или пробирки). Готовая среда должна быть прозрачной и иметь светло-янтарную окраску.

А.2.2. Добавка селективная

А.2.2.1. Состав

А.2.2.2. Приготовление

С соблюдением правил асептики растворяют новобиоцин в стерильной воде, тщательно перемешивают. Антибиотик новобиоцин подавляет рост грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий.

А.3. Среды агаризованные селективно-диагностические

А.3.1. Первая среда: агар ксилоза лизин дезоксихолатный (XLD агар)

А.3.1.1. Основа среды

А.3.1.1.1. Состав

А.3.1.1.2. Приготовление

При нагревании и частом помешивании растворяют дегидратированные компоненты основы или дегидратированную основу в воде.

Доводят до кипения, но не кипятят, избегая перегрева. Устанавливают pH так, чтобы после прогрева он составлял (7,4 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Разливают основу во флаконы подходящей вместимости. Затем прогревают на кипящей водяной бане около 5 мин.

А.3.1.2. Раствор фенолового красного

А.3.1.2.1. Состав

А.3.1.2.2. Приготовление

Феноловый красный переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре.

А.3.1.3. Приготовление чашек Петри с агаром

После прогрева среду помещают в водяную баню при температуре 44 - 47 °C, затем перемешивают и разливают приблизительно по 15 см3 в стерильные чашки Петри. Дают затвердеть.

Чашки со средой хранят в холодильнике при температуре (3 +/- 2) °C не более 5 сут.

Перед использованием подсушивают (приблизительно 30 мин) поверхность агара в чашках Петри (предпочтительней с открытой крышкой и поверхностью агара вниз) в шкафу или термостате с температурой 37 - 55 °C до тех пор, пока поверхность агара не станет сухой.

А.3.2. Вторая среда:

А.3.2.1. Среда Плоскирева.

А.3.2.2. Среда Эндо.

А.3.2.3. Среда Левина.

А.3.2.4. Агар сальмонелла-шигелла.

А.3.2.5. Агар дезоксихолатный цитратный.

А.3.2.6. Агар висмут-сульфитный.

Среды готовят в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке.

А.4. Агар питательный или ГРМ-агар

А.4.1. Состав

А.4.2. Приготовление

При нагревании растворяют компоненты в воде. Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (7,4 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Переносят питательную среду в пробирки или флаконы, стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин. Среду в пробирках при необходимости скашивают.

А.4.3. Приготовление чашек Петри с питательным агаром

После стерилизации или расплавления среду помещают в водяную баню при температуре 44 - 47 °C, затем разливают приблизительно по 15 см3 в стерильные чашки Петри. Дают затвердеть. Используют среду без подсушивания.

Допускается использование ГРМ-агара (питательный агар для культивирования микроорганизмов на основе гидролизата рыбной муки), который готовят в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке.

А.5. Агар мясо-пептонный - по ГОСТ 10444.1

А.6. Бульон мясо-пептонный с глюкозой - по ГОСТ 10444.1

Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6 - 7 см3.

А.7. Среды с углеводами (среды Гисса)

Среды готовят по ГОСТ 10444.1 или используют сухие среды с углеводами, среду из которых готовят в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке.

А.8. Агар трехсахарный железистый (TSI агар), или агар Клиглера, или агар Олькеницкого

А.8.1. Состав TSI агара

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (7,4 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Переносят по 7 - 8 см3 среды в пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин. После стерилизации оставляют в наклонном положении так, чтобы получился столбик среды высотой, равной приблизительно двум диаметрам пробирки (2 - 2,5 см), а над ним - скошенная поверхность длиной около 5 см.

Допускается использование агара Клиглера или среды Олькеницкого. Среды готовят в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке.

А.9. Агар с мочевиной (агар Кристенсена)

А.9.1. Основа среды

А.9.1.1. Состав

А.9.1.2. Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу в воде. Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (6,8 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Основу среды равномерно разливают в колбы или флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

А.9.2. Раствор мочевины

А.9.2.1. Состав

А.9.2.2. Приготовление

Мочевину помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в воде, объем раствора доводят водой до метки. Раствор мочевины стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670 через фильтры с размером диаметра пор 0,22 мкм, или текучим паром в течение 30 мин.

А.9.3. Раствор фенолового красного

А.9.3.1. Состав и приготовление - по А.3.1.2

А.9.4. Среда готовая

А.9.4.1. Состав

А.9.4.2. Приготовление

Прибавляют с соблюдением правил асептики раствор мочевины к основе, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры 44 - 47 °C. Разливают готовую среду в стерильные пробирки по 7 - 8 см3. После этого среду скашивают так, чтобы получились скошенная поверхность и столбик среды высотой, равной приблизительно двум диаметрам пробирки - 2 - 2,5 см (А.9.2).

А.10. Среда для определения L-лизин декарбоксилазы

А.10.1. Состав

А.10.2. Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу в воде. Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (6,8 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Разливают среду по 2 - 5 см3 в стерильные пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

А.10.3. Раствор бромкрезолового пурпурного

А.10.3.1. Состав

А.10.3.2. Приготовление

Бромкрезоловый пурпурный переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки.

Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

А.11. Среда для Фогес-Проскауера (VP) реакции

А.11.1. Состав

А.11.2. Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу в воде. Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (6,9 +/- 0,2) при температуре 25 °C. По 3 см3 среды разливают в пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

А.12. Реактив для Фогес-Проскауера (VP) реакции

А.12.1. Раствор креатина (N-амидиносаркозин)

А.12.1.1. Состав

А.12.1.2. Приготовление

Растворяют креатина моногидрат в воде.

А.12.2. 1-нафтол, спиртовой раствор

А.12.2.1. Состав

А.12.2.2. Приготовление

Растворяют 1-нафтол в 96%-ном этиловом спирте.

А.12.3. Калия гидроксида раствор

А.12.3.1. Состав

А.12.3.2. Приготовление

Растворяют калия гидроксид в воде в мерной колбе вместимостью 100 см3, раствор доводят водой до метки.

А.13. Среда Козера

А.13.1. Состав

А.13.2. Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу в воде. Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (7,2 +/- 0,1) при температуре 25 °C. Разливают среду мерно во флаконы подходящей вместимости. Среду стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

После стерилизации к 1 дм3 среды добавляют 10 см3 спиртового раствора бромтимолового синего, приготовленного по А.13.3. Затем по 6 - 7 см3 среды разливают в стерильные пробирки. Приготовленная среда должна иметь оливково-зеленый цвет.

А.13.3. Бромтимолового синего раствор

А.13.3.1. Состав

А.13.3.2. Приготовление

Бромтимоловый синий переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят дистиллированной водой до метки.

Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

А.14. Среда Симмонса

Для приготовления среды Симмонса к 1 дм3 среды Козера (А.13) перед стерилизацией добавляют 18 - 20 г агара. Среду после стерилизации и добавления раствора бромтимолового синего разливают по 6 - 7 см3 в стерильные пробирки или по 15 см3 в чашки Петри. Среду в пробирках скашивают.

А.15. Агар дезоксихолатный цитратный

А.15.1. Состав 1 и состав 2 - в соответствии с таблицей А.1.

А.15.2. Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу (состав 1 или состав 2) в воде. Устанавливают pH так, чтобы после нагревания для состава 1 при температуре 25 °C pH составлял (7,5 +/- 0,2) и для состава 2 при температуре 25 °C pH составлял (7,3 +/- 0,2). Среду не автоклавируют. После охлаждения до температуры 44 °C - 47 °C среду разливают приблизительно по 15 см3 в стерильные чашки Петри.

А.16. Энтероагар гектоеновый

А.16.1. Состав

А.16.2. Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу в 1 дм3 воды, кипятят в течение 1 мин, охлаждают до температуры 44 °C - 47 °C и разливают приблизительно по 15 см3 в стерильные чашки Петри.

А.17. Полужидкий питательный агар

А.17.1. Состав

А.17.2. Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу в воде. Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 +/- 0,2) при температуре 25 °C.

Перед стерилизацией среду разливают по 7 - 8 см3 в пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

А.18. Полужидкий мясо-пептонный агар

Готовят по ГОСТ 10444.1 так же, как мясо-пептонный агар, но при приготовлении добавляют 4,0 - 9,0 г агара на 1 дм3 мясо-пептонного бульона, перед стерилизацией по 7 - 8 см3 среды разливают в пробирки.

А.19. Физиологический раствор

А.19.1. Состав

А.19.2. Приготовление

Растворяют хлористый натрий в воде. Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

Готовые питательные среды хранят в соответствии с требованиями ГОСТ 10444.1.

Допускается использование готовых и дегидратированных, в т.ч. хромогенных, питательных сред аналогичного состава, разрешенных к применению в установленном порядке.

В.1. Примеры 1 и 2 схем пересева культур с селективной среды на поверхность селективно-диагностических сред приведены на рисунке В.1 <*>.

--------------------------------

<*> Предлагаемые схемы используют с целью максимального выявления всех культур, присутствующих на петле при пересеве с селективной среды.

Г.1. Интерпретация биохимических тестов для бактерий рода Shigella приведена в таблице Г1 <*>.

--------------------------------

<*> В таблице Г.1 указан процент положительных реакций.