"ГОСТ Р 53955-2010 (ИСО 15302:2007). Национальный стандарт Российской Федерации. Жиры и масла животные и растительные. Определение содержания бенз(а)пирена. Метод с применением высокоразрешающей жидкостной хроматографии с обратной фазой"
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 24.11.2010 N 507-ст)

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".

1. Подготовлен ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") и Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт жиров Российской академии сельскохозяйственных наук" (ГНУ ВНИИЖ Россельхозакадемии) на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4.

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность".

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 ноября 2010 г. N 507-ст.

4. Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 15302:2007 "Жиры и масла животные и растительные. Определение содержания бенз(а)пирена. Метод с применением высокоразрешающей жидкостной хроматографии с обратной фазой" (ISO 15302:2007 "Animal and vegetable fats and oils - Determination of benzo(a)pyrene - Reverse-phase high performance liquid chromatography method") путем изменения структуры, содержания отдельных структурных элементов, слов, фраз для учета особенностей национальной экономики и национальной стандартизации Российской Федерации, выделенных в тексте курсивом.

Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного регионального стандарта приведено в дополнительном Приложении Б.

5. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт устанавливает метод определения бенз[а]пирена в неочищенных и рафинированных пищевых животных и растительных маслах и жирах при помощи высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обратной фазой с использованием флюориметрического определения в диапазоне от 0,1 мкг/кг до 50 мкг/кг.

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие нормативные документы:

ГОСТ Р 52062-2003 Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ Р ИСО 52501-2005 (ИСО 3696:1987) Вода для лабораторного анализа. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1. Содержание бенз[а]пирена (benzo(a)pyrene content): массовая концентрация бенз(а)пирена в анализируемой пробе, определенная согласно методу, установленному в настоящем стандарте.

Примечание. Содержание выражается в микрограммах на килограмм.

Анализируемую пробу растворяют в петролейном эфире и в качестве внутреннего стандарта добавляют бензо(b)хризен. Соответствующее количество пробы адсорбируют в колонке с оксидом алюминия и элюируют петролейным эфиром с целью удаления всего присутствующего бенз(а)пирена.

Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если не указано иначе.

5.1. Вода бидистиллированная по ГОСТ Р ИСО 52501, прошедшая фильтрацию с применением мембранного фильтра с размером пор 0,45 мкм, или деионизированная вода, полученная при помощи очищающих систем деминерализации воды.

5.2. Эфир петролейный (диапазон температур кипения от 40 °C до 60 °C), или гексан, повторно дистиллированный над гранулами гидроксида калия (4 г/л).

5.3. Ацетонитрил, пригодный для ВЭЖХ.

5.4. Тетрагидрофуран, пригодный для ВЭЖХ.

5.5. Смесь ацетонитрил-тетрагидрофурана, приготовленная по 6.1.

5.6. Толуол, пригодный для ВЭЖХ.

5.7. Натрия сульфат, гранулированный, безводный.

5.8. Оксид алюминия степени активности 4, приготовленный по 6.2.

5.9. Бенз(а)пирен чистоты 99,0% по массе.

5.9.1. Базовый раствор бенз(а)пирена в толуоле, 0,5 мг/см3, приготовленный по 6.3.

5.9.2. Растворы стандартные бенз(а)пирена, приготовленные по 6.4.

5.10. Раствор бензо(b)хризена в ацетонитриле внутренний стандартный, приготовленный по 6.5.

Допускается применение других реактивов, по качеству не хуже вышеуказанных, в этом случае следует провести полный холостой анализ и привести результаты этого анализа.

6.1. Приготовление смеси ацетонитрил-тетрагидрофурана

В стакане по ГОСТ 25336 смешивают 90 см3 ацетонитрила (5.3) и 10 см3 тетрагидрофурана (5.4).

6.2. Приготовление оксида алюминия степени активности 4

Реактив приготавливают из нейтрального оксида алюминия, деактивированного добавлением 10 см3 воды (5.1) к 90 г оксида алюминия (5.8).

По причине различий в активности оксида алюминия различных марок проводят проверку с целью подтверждения, что процедура деактивации подходит для полного извлечения бенз(а)пирена из эталонной пробы.

Предупреждение. Реакция деактивации экзотермическая и возможен рост давления.

Емкость встряхивают в течение примерно 15 мин и дают содержимому прийти в уравновешенное состояние в течение 24 ч. Оксид алюминия хранят в закрытом сосуде при комнатной температуре.

6.3. Подготовка базового раствора бенз(а)пирена в толуоле массовой концентрации 0,5 мг/см3

Взвешивают с точностью до 0,1 мг около 12,5 мг бенз(а)пирена в мерной колбе по ГОСТ 1770 вместимостью 25 см3. Растворяют его в толуоле (5.6) и доводят объем раствора толуолом до метки.

Раствор хранят в темном месте при температуре 4 °C не более 6 мес.

6.4. Приготовление стандартных растворов бенз(а)пирена

Из базового раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 0,5 мг/см3 готовят два стандартных раствора с массовой концентрацией бенз(а)пирена приблизительно 0,2 мкг/см3 и 0,01 мкг/см3 разбавлением аликвот ацетонитрилом.

6.5. Приготовление внутреннего стандартного раствора бензо(b)хризена в цетонитриле

Готовят базовый раствор, содержащий с точностью до нанограмма приблизительно 10 нг/мкл вещества. Данный раствор разбавляют в 10 раз в мерной колбе для получения внутреннего стандартного раствора с концентрацией примерно 1 нг/мкл.

Примечание. Данный раствор можно также приготовить растворением бензо[b]хризена 99,0% по массе в ацетонитриле.

Используют обычную лабораторную аппаратуру и, в частности, следующую:

7.1. Колонку стеклянную для хроматографии длиной 300 мм и внутренним размером диаметра 15 мм, оснащенную припаянными стеклянными дисками и краном из политетрафторэтилена (ПТФЭ).

7.2. Бани водяные любого типа, обеспечивающие температуру нагрева (35 +/- 2) °C и (65 +/- 2) °C.

7.3. Допускается использовать испаритель мгновенного вскипания - ротационный испаритель с созданием вакуума и бани водяной, установленной на температуру 40 °C. Необходимо принимать меры для предотвращения перекрестной контаминации. В периоды между определениями систему подвергают тщательной очистке.

7.4. Хроматограф жидкостный высокоэффективный, состоящий из насоса ВЭЖХ, инжекционного клапана с замкнутым контуром для пробы на 50 мкл, колонки с обращенной фазой, электронного интегратора и регистрирующего устройства.

Если используют автодозатор, замкнутый контур для пробы между последовательными инжекциями необходимо промывать ацетонитрилом.

7.5. Колонки для анализа ВЭЖХ

7.5.1. Колонка защитная с обращенной фазой, способная отделить бенз[а]пирен от совместно экстрагируемых веществ, вместе с подходящей предколонкой (например, предколонка из нержавеющей стали длиной 75 мм и внутренним размером диаметра 4,6 мм, заполненная Lichrosorb RP-18 (размер частиц 5 мкм).

7.5.2. Колонка с обращенной фазой для ВЭЖХ длиной 250 мм и внутренним размером диаметра 4,6 мм (нержавеющая сталь) для полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) (например, Chromspher 5 РАН или Vydac 201 ТР5).

7.6. Детектор флюоресценции с длиной волны испускания 460 нм (щель 10 нм) и длиной волны возбуждения 384 нм (щель 10 нм). Детектор должен обладать требуемой производительностью для проведения анализа.

7.7. Пузырьки малого объема с суженным верхом (объемом примерно 1 мл), с прокладками со слоем ПТФЭ и алюминиевыми крышками.

7.8. Устройство ручное для обжима и насадки крышек на пузырьки.

7.9. Пипетки одноразовые.

7.10. Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 25 см3.

7.11. Пипетки по ГОСТ 29169 вместимостью 1 и 5 см3, снабженные безопасным устройством для отсасывания.

7.12. Микрошприцы для хроматографии, обеспечивающие полное заполнение петли инжектора.

Отбор проб - по ГОСТ Р 52062.

В лабораторию следует поставлять представительную пробу, которая не должна подвергаться порче или изменению во время транспортирования или хранения.

Подготовка проб - по [1].

10.1. Проба для анализа - приготовление испытуемого раствора

10.1.1. Взвешивают с точностью до 0,001 г около 0,400 г пробы продукта в стеклянном лабораторном стакане по ГОСТ 25336 и растворяют в 2 см3 петролейного эфира (5.2). Добавляют 20 мкл внутреннего стандартного раствора (5.10) при помощи микрошприца. Это эквивалентно 50 мкг/кг при пересчете на массу пробы. Если ожидается высокий уровень бенз(а)пирена, добавляют 50 мкл внутреннего стандартного раствора (5.10). Это эквивалентно 125 мкг/кг при пересчете на массу пробы.

10.1.2. Хроматографическую колонку (7.1) заполняют на половину ее высоты петролейным эфиром (5.2). Незамедлительно взвешивают 22 г оксида алюминия (5.8) в химическом стакане по ГОСТ 25336 вместимостью 50 см3 и тут же переносят в колонку, после чего осторожно встряхивают колонку для усиления эффекта седиментации оксида алюминия.

10.1.3. Добавляют безводный сульфат натрия (5.7) к верхней части колонки для образования слоя толщиной 30 мм.

10.1.4. Открывают кран и дают петролейному эфиру стечь до уровня верха слоя сульфата натрия.

10.1.5. Под колонкой помещают мерную колбу на 20 см3.

10.1.6. Вводят раствор масла (10.1.1) в колонку. Промывают колонку минимальным количеством петролейного эфира (5.2), давая слою растворителя пройти сквозь слой сульфата натрия в период между промывками.

10.1.7. Элюируют колонку с использованием петролейного эфира со скоростью потока приблизительно 1 мл/мин, удаляя первые 20 см3 элюата и собирая последующие 60 см3 элюата в круглодонную колбу объемом 100 см3.

10.1.8. Выпаривают растворитель из элюата на водяной бане, установленной на 65 °C, до объема приблизительно от 0,5 см3 до 1,0 см3 и переносят концентрированный раствор в пузырек малого объема с суженным верхом (7.7), предварительно взвешенный с точностью 0,1 мг.

10.1.9. Продолжают выпаривание из пузырька на водяной бане (5.1), установленной на температуру 35 °C, в слабом токе азота (около 25 см3/мин) до практически сухого состояния. Споласкивают круглодонную колбу 1 см3 петролейного эфира и количественно переносят промывочный раствор в пузырек, продолжая выпаривание в атмосфере азота. Процедуру ополаскивания повторяют со свежей порцией петролейного эфира и количественно переносят промывочный раствор в пузырек.

Примечание. В 10.1.9 приводится уточнение процедуры выпаривания в целях более точного сбора элюата.

10.1.10. Продолжают выпаривание при температуре 35 °C в токе азота до сухого остатка.

10.1.11. Пузырек взвешивают с точностью до 0,1 мг и рассчитывают массу остатка. Укупоривают пузырек прокладкой из ПТФЭ и алюминиевой крышкой и хранят при температуре 4 °C.

10.2. Высокоразрешающая жидкостная хроматография

10.2.1. Используют смесь из 880 см3 ацетонитрила (5.3) и 120 см3 воды (5.1) в качестве растворителя для элюирования. Дегазируют растворитель для элюирования с целью устранения кислорода во избежание гашения флюоресценции. Используют продувку гелием или подключенную установку вакуумной дегазации.

10.2.2. Элюируют со скоростью потока около 1 мл/мин.

10.2.3. Калибровочная кривая и определение относительного коэффициента чувствительности детектора

Готовят 5 разбавлений стандартного раствора бенз(а)пирена (5.9.2), таких чтобы инжекция 50 мкл каждого из них давала результаты, соответствующие 0,01 нг; 0,04 нг; 0,2 нг; 1,0 нг и 2,0 нг бенз[а]пирена. К стандартным растворам добавляют 0,5 нг внутреннего стандартного раствора. На основе данных растворов строят калибровочную кривую из пяти точек, используя площади пиков, полученные интегратором и регистрирующим устройством. Данную калибровку также используют для расчета относительного коэффициента чувствительности детектора (10.1) между бенз[а]пиреном и внутренним стандартным раствором.

10.3. Анализ проб

10.3.1. Инжектируют 250 мкл смеси ацетонитрил-тетрагидрофуран (5.5) в пузырек, содержащий очищенный остаток (10.1.11). Растворяют остаток путем осторожных круговых движений, избегая контакта растворителя с прокладкой.

Используя калибровочную кривую (10.2.3), определяют уровни бенз[а]пирена от 0,1 мкг/кг до 50 мкг/кг.

В случае концентраций больше 10 мкг/кг раствор остатка (10.3.2) разбавляют далее смесью ацетонитрил-тетрагидрофуран (5.5) или инжектируют меньший объем, чем 50 мкл (10.3.2).

10.3.2. Инжектируют точно известный объем, примерно 50 мкл растворенного остатка, в колонку для ВЭЖХ и начинают процесс хроматографии.

Необходимо принять меры, чтобы гарантировать введение не более 1,5 мг остатка в колонку. Если присутствует большее количество остатка, необходимо отрегулировать количество тетрагидрофурана (5.4) или повторить стадию очистки.

11.1. Расчет относительных коэффициентов чувствительности

На основе полученных данных (10.2.3) рассчитывают относительный коэффициент чувствительности в качестве среднего арифметического значения пяти стандартных растворов с использованием уравнения:

где - площадь пика внутреннего стандартного раствора;

- концентрация бенз(а)пирена, микрограмм на литр;

- площадь пика бенз(а)пирена;

- концентрация внутреннего стандартного раствора, микрограмм на литр.

11.2. Расчет содержания бенз(а)пирена

Содержание бенз(а)пирена , мкг/кг, в анализируемой пробе рассчитывают с использованием уравнения:

где m - масса анализируемой пробы, г;

- средний коэффициент чувствительности, рассчитанный на основе стандартных растворов (11.1).

Содержание бенз[а]пирена выражается в качестве фракции массы в микрограммах на килограмм с точностью до одного десятичного знака для содержания от 0 мкг/кг до 10 мкг/кг и до ближайшего целого числа - для содержания, превышающего 10 мкг/кг.

12.1. Повторяемость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами испытаний, полученными с использованием одного и того же метода, применительно к идентичному испытуемому материалу, в той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования в течение короткого периода времени, должна не более чем в 5% случаев превышать предел сходимости r, приведенный в Приложении А (таблица А.1).

12.2. Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами испытаний, полученными с использованием одного и того же метода, применительно к идентичному испытуемому материалу, в различных лабораториях, различными операторами, с использованием различного оборудования, должна не более чем в 5% случаев превышать предел воспроизводимости R, приведенный в Приложении А (таблица А.1).

В 16 лабораториях из 7 стран были осуществлены международные совместные испытания трех образцов с различным содержанием бенз(а)пирена (низким, средним и высоким). Результаты пяти лабораторий не были приняты во внимание, т.к. они были основаны не на протоколе метода, а на собственных внутренних методах.

Испытания были организованы в 2006 г. комитетом-членом (Голландия), полученные результаты прошли статистический анализ в соответствии с ИСО 5725-2 [2] с целью получения данных относительно точности, приведенных в таблице А.1.