"ГОСТ 32123-2013 (ISO 15302:2007). Межгосударственный стандарт. Жиры и масла животные и растительные. Определение содержания бенз(а)пирена. Метод с применением высокоразрешающей жидкостной хроматографии с обратной фазой"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 27.06.2013 N 224-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") и Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт жиров" Российской Академии сельскохозяйственных наук" (ГНУ ВНИИЖ Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2013 г. N 43)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июня 2013 г. N 224-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32123-2013 (ISO 15302:2007) введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ISO 15302:2007 Animal and vegetable fats and oils - Determination of benzo[a]pyrene - Reverse-phase high performance liquid chromatography method (Жиры и масла животные и растительные. Определение содержания бенз(а)пирена. Метод с применением высокоразрешающей жидкостной хроматографии с обратной фазой). При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта, выделены в тексте стандарта курсивом.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53955-2010 (ИСО 15302:2007)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Настоящий стандарт устанавливает метод определения бенз[а]пирена в неочищенных и рафинированных пищевых животных и растительных маслах и жирах при помощи высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обратной фазой с использованием флюориметрического определения в диапазоне от 0,1 мкг/кг до 50 мкг/кг.

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением.

3.1 содержание бенз[а]пирена (benzo[a]pyrene content): Массовая концентрация бенз[а]пирена в анализируемой пробе, определенная согласно методу, установленному в настоящем стандарте.

Примечание - Содержание выражается в микрограммах на килограмм.

Анализируемую пробу растворяют в петролейном эфире и в качестве внутреннего стандарта добавляют бензо[b]хризен. Соответствующее количество пробы адсорбируют в колонке с оксидом алюминия и элюируют петролейным эфиром с целью удаления всего присутствующего бенз[а]пирена.

Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если не указано иначе.

5.1 Вода бидистиллированная по ИСО 3696, прошедшая фильтрацию с применением мембранного фильтра с размером пор 0,45 мкм или деионизированная вода, полученная при помощи очищающих систем деминерализации воды.

5.2 Эфир петролейный (диапазон температур кипения от 40 °C до 60 °C), или гексан, повторно дистиллированный над гранулами гидроксида калия (4 г/л).

5.3 Ацетонитрил, пригодный для ВЭЖХ.

5.4 Тетрагидрофуран, пригодный для ВЭЖХ.

5.5 Смесь ацетонитрил-тетрагидрофуран, приготовленная по 6.1.

5.6 Толуол, пригодный для ВЭЖХ.

5.7 Натрия сульфат, гранулированный, безводный.

5.8 Оксид алюминия степени активности 4, приготовленный по 6.2.

5.9 Бенз[а]пирен, чистоты 99,0% по массе.

5.9.1 Базовый раствор бенз[а]пирена в толуоле, 0,5 мг/см³, приготовленный по 6.3.

5.9.2 Растворы стандартные бенз[а]пирена, приготовленные по 6.4.

5.10 Раствор бензо[b]хризена в ацетонитриле внутренний стандартный, приготовленный по 6.5.

Допускается применение других реактивов по качеству не хуже вышеуказанных, в этом случае следует провести полный холостой анализ и привести результаты этого анализа.

В стакане по ГОСТ 25336 смешивают 90 см³ ацетонитрила (5.3) и 10 см³ тетрагидрофурана (5.4).

Реактив приготавливают из нейтрального оксида алюминия, деактивированный добавлением 10 см³ воды (5.1) к 90 г оксида алюминия (5.8).

По причине различий в активности оксида алюминия различных марок проводят проверку с целью подтверждения, что процедура деактивации подходит для полного извлечения бенз[а]пирена из эталонной пробы.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - реакция деактивации экзотермическая и возможен рост давления.

Емкость встряхивают в течение примерно 15 мин и дают содержимому прийти в уравновешенное состояние в течение 24 ч. Оксид алюминия хранят в закрытом сосуде при комнатной температуре.

6.3 Подготовка базового раствора бенз[а]пирена в толуоле, массовой концентрации 0,5 мг/см³

Взвешивают, с точностью до 0,1 мг, около 12,5 мг бенз[а]пирена в мерной колбе по ГОСТ 1770 вместимостью 25 см³. Растворяют его в толуоле (5.6) и доводят объем раствора толуолом до метки.

Раствор хранят в темном месте при температуре 4 °C не более 6 мес.

Из базового раствора бенз[а]пирена, массовой концентрации 0,5 мг/см³, готовят два стандартных раствора с массовой концентрацией бенз[а]пирена приблизительно 0,2 мкг/см³ и 0,01 мкг/см³, разбавлением аликвот ацетонитрилом.

Готовят базовый раствор, содержащий, с точностью до нанограмма, приблизительно 10 нг/мкл вещества. Данный раствор разбавляют в 10 раз в мерной колбе для получения внутреннего стандартного раствора с концентрацией примерно 1 нг/мкл.

Примечание - Данный раствор можно также приготовить растворением бензо[b]хризена, 99,0% по массе, в ацетонитриле.

Используют обычную лабораторную аппаратуру и, в частности, следующую:

7.1 Колонку стеклянную для хроматографии, длиной 300 мм и внутренним размером диаметра 15 мм, оснащенную припаянными стеклянными дисками и краном из политетрафторэтилена (ПТФЭ).

7.2 Бани водяные любого типа, обеспечивающие температуру нагрева (35 +/- 2) °C и (65 +/- 2) °C.

7.3 Допускается использовать испаритель мгновенного вскипания - ротационный испаритель с созданием вакуума и бани водяной, установленной на температуру 40 °C. Необходимо принимать меры для предотвращения перекрестной контаминации. В периоды между определениями систему подвергают тщательной очистке.

7.4 Хроматограф жидкостный высокоэффективный, состоящий из насоса ВЭЖХ, инжекционного клапана с замкнутым контуром для пробы на 50 мкл, колонки с обращенной фазой, электронного интегратора и регистрирующего устройства.

Если используют автодозатор, замкнутый контур для пробы между последовательными инжекциями необходимо промывать ацетонитрилом.

7.5 Колонки для анализа ВЭЖХ

7.5.1 Колонка защитная с обращенной фазой, способная отделить бенз[а]пирен от совместно экстрагируемых веществ, вместе с подходящей предколонкой (например, предколонка из нержавеющей стали длиной 75 мм и внутренним размером диаметра 4,6 мм, заполненная Lichrosorb RP-18 (размер частиц 5 мкм).

7.5.2 Колонка с обращенной фазой для ВЭЖХ, длиной 250 мм и внутренним размером диаметра 4,6 мм (нержавеющая сталь), для полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) (например, Chromspher 5 PAH или Vydac 201 TP5).

7.6 Детектор флюоресценции, с длиной волны испускания 460 нм (щель 10 нм) и длиной волны возбуждения 384 нм (щель 10 нм). Детектор должен обладать требуемой производительностью для проведения анализа.

7.7 Пузырьки малого объема с суженным верхом (объемом примерно 1 мл), с прокладками со слоем ПТФЭ и алюминиевыми крышками.

7.8 Устройство ручное для обжима и насадки крышек на пузырьки.

7.9 Пипетки одноразовые.

7.10 Колбы мерные по ГОСТ 1770, вместимостью 25 см³.

7.12 Пипетки по ГОСТ 29169, вместимостью 1 и 5 см³, снабженные безопасным устройством для отсасывания.

7.13 Микрошприцы для хроматографии, обеспечивающие полное заполнение петли инжектора.

Отбор проб - по ИСО 5555.

В лабораторию следует поставлять представительную пробу, которая не должна подвергаться порче или изменению во время транспортирования или хранения.

Подготовка проб - по ИСО 661.

10.1 Проба для анализа и приготовление испытуемого раствора

10.1.1 Взвешивают, с точностью до 0,001 г, около 0,400 г пробы продукта в стеклянном лабораторном стакане по ГОСТ 25336 и растворяют в 2 см³ петролейного эфира (5.2). Добавляют 20 мкл внутреннего стандартного раствора (5.10) при помощи микрошприца. Это эквивалентно 50 мкг/кг при пересчете на массу пробы. Если ожидается высокий уровень бенз[а]пирена, добавляют 50 мкл внутреннего стандартного раствора (5.10). Это эквивалентно 125 мкг/кг при пересчете на массу пробы.

10.1.2 Хроматографическую колонку (7.1) заполняют на половину ее высоты петролейным эфиром (5.2). Незамедлительно взвешивают 22 г оксида алюминия (5.8) в химическом стакане по ГОСТ 25336 вместимостью 50 см³ и тут же переносят в колонку, после чего осторожно встряхивают колонку для усиления эффекта седиментации оксида алюминия.

10.1.3 Добавляют безводный сульфат натрия (5.7) к верхней части колонки для образования слоя толщиной 30 мм.

10.1.4 Открывают кран и дают петролейному эфиру стечь до уровня верха слоя сульфата натрия.

10.1.5 Под колонкой помещают мерную колбу на 20 см³.

10.1.6 Вводят раствор масла (10.1.1) в колонку. Промывают колонку минимальным количеством петролейного эфира (5.2), давая слою растворителя пройти сквозь слой сульфата натрия в период между промывками.

10.1.7 Элюируют колонку с использованием петролейного эфира со скоростью потока приблизительно 1 мл/мин, удаляя первые 20 см³ элюата и собирая последующие 60 см³ элюата в круглодонную колбу объемом 100 см³.

10.1.8 Выпаривают растворитель из элюата на водяной бане, установленной на 65 °C, до объема приблизительно от 0,5 см³ до 1,0 см³, и переносят концентрированный раствор в пузырек малого объема с суженным верхом (7.7), предварительно взвешенный с точностью 0,1 мг.

10.1.9 Продолжают выпаривание из пузырька на водяной бане (5.1), установленной на температуру 35 °C в слабом токе азота (около 25 см³/мин) до практически сухого состояния. Споласкивают круглодонную колбу 1 мл петролейного эфира и количественно переносят промывочный раствор в пузырек, продолжая выпаривание в атмосфере азота. Процедуру ополаскивания повторяют со свежей порцией петролейного эфира, и количественно переносят промывочный раствор в пузырек.

10.1.10 Продолжают выпаривание при температуре 35 °C в токе азота до сухого остатка.

10.1.11 Пузырек взвешивают с точностью до 0,1 мг и рассчитывают массу остатка. Укупоривают пузырек прокладкой из ПТФЭ и алюминиевой крышкой и хранят при температуре 4 °C.

10.2 Высокоразрешающая жидкостная хроматография

10.2.1 Используют смесь из 880 см³ ацетонитрила (5.3) и 120 см³ воды (5.1) в качестве растворителя для элюирования. Дегазируют растворитель для элюирования с целью устранения кислорода во избежание гашения флюоресценции. Используют продувку гелием или подключенную установку вакуумной дегазации.

10.2.2 Элюируют со скоростью потока около 1 мл/мин.

10.2.3 Калибровочная кривая и определение относительного коэффициента чувствительности детектора

Готовят 5 разбавлений стандартного раствора бенз[а]пирена (5.9.2) таких, чтобы инжекция 50 мкл каждого из них давала результаты, соответствующие 0,01 нг, 0,04 нг, 0,2 нг, 1,0 нг и 2,0 нг бенз[а]пирена. К стандартным растворам добавляют 0,5 нг внутреннего стандарта. На основе данных растворов строят калибровочную кривую из пяти точек, используя площади пиков, полученные интегратором и регистрирующим устройством. Данную калибровку также используют для расчета относительного коэффициента чувствительности детектора (10.1), между бенз[а]пиреном и внутренним стандартным раствором.

10.3 Анализ проб

10.3.1 Инжектируют 250 мкл смеси ацетонитрил-тетрагидрофуран (5.5) в пузырек, содержащий очищенный остаток (10.1.11). Растворяют остаток путем осторожных круговых движений, избегая контакта растворителя с прокладкой.

Используя калибровочную кривую (10.2.3), определяют уровни бенз[а]пирена от 0,1 мкг/кг до 50 мкг/кг.

В случае концентраций больше 10 мкг/кг раствор остатка (10.3.2) разбавляют далее смесью ацетонитрил-тетрагидрофуран (5.5), или инжектируют меньший объем, чем 50 мкл (10.3.2).

10.3.2 Инжектируют точно известный объем, примерно 50 мкл растворенного остатка в колонку для ВЭЖХ и начинают процесс хроматографии.

Необходимо принять меры, чтобы гарантировать введение не более 1,5 мг остатка в колонку. Если присутствует большее количество остатка, необходимо отрегулировать количество тетрагидрофурана (5.4) или повторить стадию очистки.

11.1 Расчет относительных коэффициентов чувствительности

На основе полученных данных (10.2.3) рассчитывают относительный коэффициент чувствительности, f_rr, в качестве среднего арифметического значения пяти стандартных растворов с использованием уравнения:

где A_is - площадь пика внутреннего стандартного раствора;

- концентрация бенз[а]пирена, микрограмм на литр;

A_BaP - площадь пика бенз[а]пирена;

- концентрация внутреннего стандартного раствора, микрограмм на литр.

11.2 Расчет содержания бенз[а]пирена

Содержание бенз[а]пирена, W_BaP, мкг/кг, в анализируемой пробе рассчитывают с использованием уравнения:

где m - масса анализируемой пробы, г;

f_rr - средний коэффициент чувствительности, рассчитанный на основе стандартных растворов (11.1).

Содержание бенз[а]пирена выражается в качестве фракции массы в микрограммах на килограмм с точностью до одного десятичного знака для содержания от 0 мкг/кг до 10 мкг/кг и до ближайшего целого числа для содержания, превышающего 10 мкг/кг.

12.1 Повторяемость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами испытаний, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному испытуемому материалу в той же лаборатории, одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в течение короткого периода времени, должна не более чем в 5% случаев превышать предел сходимости, r, приведенный в приложении А (таблица А.1).

12.2 Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами испытаний, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному испытуемому материалу в различных лабораториях, различными операторами с использованием различного оборудования, должна не более чем в 5% случаев превышать предел воспроизводимости, R, приведенный в приложении А (таблица А.1).

В 16 лабораториях из 7 стран были осуществлены международные совместные испытания трех образцов с различным содержанием бенз[а]пирена (низким, средним и высоким). Результаты пяти лабораторий не были приняты во внимание, так как они были основаны не на протоколе метода, а на собственных внутренних методах.

Испытания были организованы в 2006 г. комитетом-членом (Голландия), полученные результаты прошли статистический анализ в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-2 с целью получения данных относительно точности, приведенных в таблице А.1.