"ФС.2.3.0005. Фармакопейная статья. Протамина сульфат"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 N 377)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание")

[9009-65-8]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Сульфаты основных пептидов, извлеченных из сперматозоидов или молоки рыб, обычно видов Salmonidae. Связывается с гепарином в растворе, ингибируя его антикоагулянтную активность; в условиях анализа это связывание приводит к образованию осадка. В расчете на высушенное вещество 1 мг протамина сульфата осаждает не менее 100 МЕ гепарина.

Содержит не менее 90,0% и не более 110,0% протамина сульфата в пересчете на сухое и свободное от серной кислоты вещество.

СВОЙСТВА

Описание. Белый или почти белый порошок со слабым характерным запахом.

<*> Гигроскопичен.

--------------------------------

<*> Приводится для информации.

Растворимость. Умеренно растворим в воде, практически нерастворим в спирте 96%.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ

1. Антигепариновая активность. Должна соответствовать требованиям раздела "Количественное определение".

2. ВЭЖХ. Время удерживания четырех основных пиков (протаминовых пептидов A, B, C, D) на хроматограмме испытуемого раствора должно соответствовать времени удерживания пиков (протаминовых пептидов A, B, C, D), на хроматограмме раствора стандартного образца протамина сульфата (раздел "Родственные примеси").

Относительное содержание пептидов A, B, C, D в субстанции рассчитывают методом внутренней нормализации. Содержание пептида A в испытуемом растворе должно составлять от 13 до 18%; пептида B - от 21 до 28%; пептида C - от 31 до 38%; пептида D - от 19 до 24%.

3. Качественная реакция. К 0,5 мл раствора А, полученного в испытании "Прозрачность раствора", прибавляют 4,5 мл воды, 1,0 мл натрия гидроксида раствора 10%, 1,0 мл раствора 0,1% и перемешивают. Смесь охлаждают до 5 °C и прибавляют 0,5 мл натрия гипобромита раствора; должно образоваться красное окрашивание.

4. Качественная реакция. Субстанция должна давать реакцию на сульфаты (ОФС "Общие реакции на подлинность").

ИСПЫТАНИЯ

Удельное вращение. От -65 до -85 в пересчете на сухое вещество (1% раствор субстанции в хлористоводородной кислоты растворе 0,1 М, ОФС "Оптическое вращение").

Прозрачность раствора. Растворяют 0,2 г субстанции в 10 мл воды (раствор А). К 2,5 мл полученного раствора прибавляют 7,5 мл воды. Полученный раствор должен выдерживать сравнение с эталоном II (ОФС "Прозрачность и степень опалесценции (мутности) жидкостей").

Цветность раствора. Раствор, полученный в испытании "Прозрачность раствора", должен выдерживать сравнение с эталоном BY₆ или Y₆ (ОФС "Степень окраски жидкостей", метод 2).

Оптическая плотность. Оптическая плотность 1,0% раствора субстанции в воде, измеренная при длине волн от 260 до 280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, не должна превышать 0,1 (ОФС "Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях").

pH. От 6,0 до 7,5 (1,0% раствор субстанции, ОФС "Ионометрия", метод 3).

Родственные примеси. Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография").

Растворы используют свежеприготовленными.

Подвижная фаза А (ПФА). Трифторуксусная кислота - ацетонитрил - вода 1:50:950.

Подвижная фаза Б (ПФБ). Трифторуксусная кислота - ацетонитрил - вода 1:500:500.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 30 мг субстанции, растворяют в 400 мкл хлористоводородной кислоты 6 М и доводят объем раствора хлористоводородной кислотой 0,01 М до метки.

Раствор стандартного образца протамина сульфата. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 3 мг (точная навеска) фармакопейного стандартного образца протамина сульфата, содержащего пептиды A, B, C, D, растворяют в 40 мкл хлористоводородной кислоты раствора 6 М и доводят объем раствора хлористоводородной кислоты раствором 0,01 М до метки.

Раствор для проверки пригодности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл раствора стандартного образца протамина сульфата и доводят объем раствора хлористоводородной кислоты раствором 0,01 М до метки.

Хроматографируют раствор для проверки пригодности хроматографической системы, раствор стандартного образца протамина сульфата и испытуемый раствор.

Относительное время удерживания соединений. Пептид A - 1 (от 9 до 13 мин); пептид B - около 1,05; пептид C - около 1,10; пептид D - около 1,15.

Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора стандартного образца протамина сульфата:

- должно наблюдаться 4 основных пика (пептиды от A до D), время удерживания которых должно находиться в пределах от 8 до 17 мин;

- разрешение (R) между пиками пептида A и пептида B должно быть не менее 2,0; между пиками пептида B и пептида C должно быть не менее 2,0; между пиками пептида C и пептида D должно быть не менее 2,0;

- фактор асимметрии (A_s) пика пептида A должен быть не более 1,8; пика пептида B - не более 1,5; пика пептида C - не более 2,5; пика пептида D - не более 2,2;

- относительное стандартное отклонение суммы площадей пиков пептидов A, B, C и D - не более 2% (6 введений);

- отношение сигнал/шум (S/N) для пика пептида A на хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы - не менее 10.

Допустимое содержание примесей. Суммарное содержание примесей в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле:

где S_A + S_B + S_c + S_D - сумма площадей пиков пептидов A, B, C и D на хроматограмме испытуемого раствора;

- сумма площадей всех пиков на хроматограмме испытуемого раствора.

Допустимое суммарное содержание примесей - не более 8,0%.

При суммарном содержании примесей менее 0,5% результат испытания указывают как "менее 0,5%".

Потеря в массе при высушивании. Не более 5,0% (ОФС "Потеря в массе при высушивании"). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.

Азот. От 21,0 до 26,0%, в пересчете на сухое вещество (ОФС "Определение азота в органических соединениях методом Къельдаля", метод 1). Для определения используют 70 мг субстанции и проводят минерализацию в течение 3 - 4 часов. В качестве титранта используют 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты.

Железо. Не более 0,001% (ОФС "Железо", метод 2). Растворяют 1,0 г субстанции при нагревании в 10 мл воды.

Сульфаты. Не менее 16% и не более 24%, в пересчете на сухое вещество. В химический стакан помещают 0,15 г (точная навеска) субстанции, растворяют в 15 мл воды, прибавляют 5 мл хлористоводородной кислоты разведенной 7,3%, нагревают до кипения и медленно прибавляют к кипящему раствору 10 мл бария хлорида раствора 10%. Накрывают стакан, нагревают в течение 1 ч на водяной бане и фильтруют. Осадок промывают несколько раз горячей водой, до отрицательной реакции на хлориды, высушивают и прокаливают в предварительно взвешенном тигле при температуре от 550 до 650 °C до постоянной массы.

1,0 г остатка соответствует 0,4117 г сульфатов SO₄.

Сульфатная зола. Не более 0,5% (ОФС "Сульфатная зола"). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.

Ртуть. Не более 0,001%.

Растворитель. Азотная кислота концентрированная - серная кислота концентрированная 1:1.

Испытуемый раствор. В коническую колбу вместимостью 250 мл помещают 2,0 г субстанции, прибавляют 20,0 мл растворителя, кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч, охлаждают и осторожно разбавляют водой. Кипятят до полного исчезновения паров азотной кислоты. Смесь охлаждают и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводят объем раствора водой до метки и фильтруют. Переносят 50,0 мл фильтрата в делительную воронку, встряхивают последовательно с небольшими порциями хлороформа до обесцвечивания хлороформного слоя. Отделяют хлороформный слой. К водному слою прибавляют 25,0 мл серной кислоты разведенной 9,8%, 115,0 мл воды и 10,0 мл гидроксиламина гидрохлорида раствора 20%. Титруют дитизона раствором 0,0012%, после каждого прибавления титранта смесь тщательно перемешивают, к концу титрования смесь оставляют для разделения слоев. Отделяют хлороформный слой и продолжают титровать до появления синевато-зеленого окрашивания.

Параллельно проводят контрольный опыт.

Рассчитывают содержание ртути, используя эквивалент в мкг ртути на 1 мл титранта, определенный при установке титра дитизона раствора 0,0012%.

Тяжелые металлы. Не более 0,002%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Тяжелые металлы" (метод 3Б), в остатке, полученном в испытании "Сульфатная зола", с использованием эталонного раствора 2.

Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС "Остаточные органические растворители".

Аномальная токсичность. Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС "Аномальная токсичность"). Тест-доза - 0,5 мг субстанции в 0,5 мл воды для инъекций на мышь. Срок наблюдения 48 ч.

Бактериальные эндотоксины. Не более 2,33 ЕЭ на 1 мг субстанции (ОФС "Бактериальные эндотоксины").

Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС "Микробиологическая чистота".

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Антигепариновая активность. Определение проводят методом титриметрии.

Все испытуемые растворы и раствор стандартного образца протамина сульфата готовятся в двух повторностях; для каждого раствора проводится 3 определения.

Испытуемый раствор А. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 15 мг (точная навеска) субстанции, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.

Испытуемый раствор Б. К 10,0 мл испытуемого раствора A прибавляют 5,0 мл воды и перемешивают.

Испытуемый раствор В. К 10,0 мл испытуемого раствора A прибавляют 20,0 мл воды и перемешивают.

Раствор стандартного образца гепарина натрия (титрант). Готовят раствор фармакопейного стандартного образца гепарина натрия в воде с концентрацией гепарина натрия около 170 МЕ/мл.

В кювету помещают 1,5 мл титруемого раствора (испытуемый раствор А; испытуемый раствор Б; испытуемый раствор В), устанавливают подходящую длину волны в видимой области спектра, прибавляют титрант в малых количествах до резкого увеличения абсорбции и записывают объем.

Антигепариновая активность. Количество связанного гепарина натрия в МЕ на 1 мг субстанции (A) вычисляют по формуле:

где V_i - объем титранта, израсходованный на титрование каждого испытуемого раствора, мл;

C_T - концентрация гепарина натрия, МЕ/мл;

C_i - номинальная концентрация протамина сульфата в каждом испытуемом растворе, мг/мл.

Относительное стандартное отклонение антигепариновой активности для каждого испытуемого раствора должно быть не более 5,0%.

За результат антигепариновой активности принимают среднее значение из 18 определений.

Белок. Определение проводят методом ВЭЖХ в условиях испытания "Родственные примеси" со следующими изменениями.

Хроматографируют раствор стандартного образца протамина сульфата и испытуемый раствор.

Содержание протамина сульфата в процентах (X) вычисляют по формуле:

где S₁ - среднее значение суммы площадей пиков пептидов A, B, C, D на хроматограмме испытуемого раствора;

S₀ - среднее значение суммы площадей пиков пептидов A, B, C, D на хроматограмме раствора стандартного образца протамина сульфата;

a₁ - навеска субстанции, мг;

a₀ - навеска стандартного образца протамина сульфата, мг;

P - содержание протамина в стандартном образце протамина сульфата, мг;

W - потеря в массе при высушивании, %;

R - содержание сульфатов в субстанции, в %.

ХРАНЕНИЕ

В герметично укупоренной упаковке, в защищенном от света месте.