"ФС.2.3.0007. Фармакопейная статья. Гепарин натрия"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 N 377)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание")

Мукополисахарид эфира полисерной кислоты.

Гепарин натрия представляет собой натриевую соль глюкозаминогликана, содержащего сульфатированные и ацетилированные остатки D-глюкозамина, D-глюкуроновой кислоты и L-идуроновой кислоты. При полном гидролизе гепарина натрия образуются D-глюкозамин, D-глюкуроновая кислота, L-идуроновая кислота, уксусная кислота и серная кислота. Гепарин натрия обладает свойством удлинять время свертывания крови катализируя ингибирование тромбина и фактора Xa антитромбином. Гепарин натрия получают из легких крупного рогатого скота или мукозы кишечника свиней. Для получения исходного сырья используют животных, у которых отсутствуют опасные для человека заболевания вирусной, бактериальной, микоплазменной и прионной этиологии.

Анти-IIa активность субстанции должна составлять не менее 180 МЕ/мг (C₂₄H₃₁N₂Na₇O₃₅S₅)_n в пересчете на сухое вещество.

Описание. Аморфный порошок белого или почти белого цвета.

<*> Гигроскопичен.

--------------------------------

<*> Приводится для информации.

Растворимость. Легко растворим в воде.

1. Анти-IIa активность. Проводят определение анти-IIa активности в соответствии с ОФС "Методы количественного определения гепарина" (определение анти-IIa активности НФГ).

2. Активность. Проводят определение анти-Xa активности в соответствии с ОФС "Методы количественного определения гепарина" (определение анти-Xa активности НФГ). Отношение анти-Xa активности к анти-IIa активности, определенной в соответствии с разделом "Количественное определение", должно быть от 0,9 до 1,1.

3. ВЭЖХ. Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора А должно соответствовать времени удерживания пика гепарина на хроматограмме стандартного раствора В (раздел "Родственные примеси").

4. ¹H-ЯМР-спектроскопия (ОФС "Спектроскопия ядерного магнитного резонанса").

Растворитель. Дейтерия оксид, содержащий 0,02 мг/мл дейтерированного триметилсилилпропионата натрия.

Примечание - В растворитель может быть добавлен 0,012 мг/мл натрия эдетата дигидрат, если в спектре испытуемого образца или образца сравнения сигнал при 5,22 м.д. меньше 80% от сигнала при 5,44 м.д.

Все растворы натрия эдетата дигидрата и натрия тетрадейтеродиметилсилапентаноата хранят в контейнере из полиэтилена высокой плотности.

Испытуемый раствор. Растворяют 20 мг субстанции в 0,7 мл растворителя.

Раствор стандартного образца гепарина натрия. Растворяют 20 мг фармакопейного стандартного образца гепарина натрия для ЯМР идентификации в 0,7 мл растворителя.

Раствор для проверки пригодности системы. Растворяют 0,15 мг стандартного образца избыточно сульфатированного хондроитин сульфата в 1,0 мл раствора сравнения.

Оборудование. Импульсный ЯМР-спектрометр с рабочей частотой на протонах не менее 300 МГц.

Параметры регистрации ¹H ЯМР спектров

Примечание - Спектры испытуемого раствора и раствора фармакопейного стандартного образца гепарина натрия должны записываться без вращения образца и при одинаковой температуре.

Параметры обработки ¹H ЯМР спектров

Параметры пригодности системы. На спектре раствора для проверки пригодности хроматографической системы сигналы протонов метильных групп N-ацетильных фрагментов гепарина и гиперсульфатированного хондроитинсульфата должны наблюдаться при 2,05 +/- 0,02 и 2,16 +/- 0,03 м.д. соответственно.

Анализ ¹H ЯМР спектров

Спектр испытуемого раствора должен качественно соответствовать спектру раствора стандартного образца гепарина натрия после нормализации обоих спектров с целью уравнивания их по интенсивности. Допускается изменение соотношения интенсивностей некоторых сигналов в области от 3,35 до 4,55 м.д. при сохранении подобия общего вида спектров.

В спектрах должны присутствовать основные сигналы гепарина натрия (м.д.): 2,04 +/- 0,03; 3,27 +/- 0,03 (дублет); 4,34 +/- 0,03; 5,22 +/- 0,03; 5,42 +/- 0,03. Допускается появление дополнительного сигнала при 2,08 +/- 0,02 (дерматан сульфат).

В спектрах не должно наблюдаться не идентифицированных сигналов в областях от 0,10 до 2,00 м.д., от 2,10 до 3,10 м.д. и от 5,70 до 8,00 м.д. высотой более 4% от высоты сигнала при 5,42 м.д. Допускается наличие идентифицированных сигналов протонов остаточных растворителей и других технологических примесей.

5. Субстанция должна соответствовать требованиям раздела "Натрий".

Удельное вращение. Не менее +35 в пересчете на сухое вещество (4% раствор субстанции в воде, ОФС "Оптическое вращение").

Прозрачность раствора. Раствор, содержащий в 1 мл 5000 МЕ субстанции, должен быть прозрачным (ОФС "Прозрачность и степень опалесценции (мутности) жидкостей").

Цветность раствора. Раствор, приготовленный в испытании "Прозрачность раствора" должен выдерживать сравнение с эталоном 5 подходящего цвета (ОФС "Степень окраски жидкостей").

pH. От 5,5 до 8,0 (1% раствор в воде, свободной от углерода диоксида, ОФС "Ионометрия", метод 3).

Примеси нуклеотидов. Оптическая плотность 0,4% раствора субстанции в воде, измеренная в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 260 нм, не должна превышать 0,15 (ОФС "Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях").

Белок. Не более 0,5% (в пересчете на сухое вещество). (ОФС "Определение белка", метод 2 (А)).

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,5 г (точная навеска) субстанции, растворяют в воде, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов на спектрофотометре при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя 5 см.

Родственные примеси. Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография").

Подвижная фаза А (ПФА). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 0,4 г натрия дигидрофосфата дигидрата, растворяют в воде, доводят значение pH фосфорной кислотой разведенной 10% до 3,0 и доводят объем раствора водой до метки. Раствор используют свежеприготовленным.

Подвижная фаза Б (ПФБ). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 0,40 г натрия дигидрофосфата дигидрата и 140 г натрия перхлората, растворяют в воде, доводят значение pH фосфорной кислотой разведенной 10% до 3,0 и доводят объем раствора водой до метки; фильтруют и дегазируют. Раствор используют свежеприготовленным.

Испытуемый раствор А. В мерную колбу вместимостью 5 мл помещают 50 мг субстанции (точная навеска), растворяют в воде при помощи вихревой мешалки, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Испытуемый раствор Б. Растворяют 0,1 г (точная навеска) субстанции в 1,0 мл воды при помощи вихревой мешалки. К 0,5 мл полученного раствора прибавляют 0,25 мл хлористоводородной кислоты раствора 1 М, 50 мкл натрия нитрита раствора 25% и выдерживают при комнатной температуре в течение 40 мин. Для остановки реакции к полученной смеси прибавляют 0,2 мл натрия гидроксида раствора 1 М.

Раствор стандартного образца гепарина. Растворяют 0,25 г (точная навеска) фармакопейного стандартного образца гепарина для физико-химического анализа в 2,0 мл воды при помощи вихревой мешалки.

Стандартный раствор А. К 1,2 мл раствора стандартного образца гепарина для физико-химического анализа прибавляют 0,3 мл фармакопейного стандартного образца дерматана сульфата и гиперсульфатированного хондроитина сульфата (содержит 10 мг/мл дерматана сульфата и 2,5 мг/мл гиперсульфатированного хондроитина сульфата) и гомогенизируют при помощи вихревой мешалки.

Стандартный раствор Б. К 0,5 мл стандартного раствора А прибавляют 0,25 мл 1 М раствора хлористоводородной кислоты, 50 мкл натрия нитрита раствора 25% и выдерживают при комнатной температуре в течение 40 мин. Для остановки реакции к полученной смеси прибавляют 0,2 мл 1 М раствора натрия гидроксида.

Стандартный раствор В. К 0,1 мл стандартного раствора А прибавляют 0,9 мл воды и гомогенизируют при помощи вихревой мешалки.

Контрольный раствор. К 0,4 мл раствора стандартного образца гепарина для физико-химического анализа прибавляют 0,1 мл воды, перемешивают при помощи вихревой мешалки, далее прибавляют 0,25 мл хлористоводородной кислоты раствора 1 М, 50 мкл натрия нитрита раствора 25% и выдерживают при комнатной температуре в течение 40 мин. Для остановки реакции к полученной смеси прибавляют 0,2 мл натрия гидроксида раствора 1 М.

Колонку уравновешивают в течение не менее 15 мин.

Хроматографируют контрольный раствор, стандартный раствор Б, стандартный раствор В, испытуемый раствор А и испытуемый раствор Б.

Относительное время удерживания соединений. Гепарин - 1 (около 26 мин); дерматана сульфат и хондроитина сульфат - около 0,9; гиперсульфатированный хондроитин сульфат - около 1,3.

Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме контрольного раствора должен отсутствовать пик с относительным временем удерживания гепарина.

На хроматограмме стандартного раствора Б:

- разрешение (R_S) между суммарным пиком дерматана сульфата и хондроитина сульфата и гиперсульфатированного хондроитина должно быть не менее 3,0;

- отношение сигнал/шум (S/N) для суммарного пика дерматана сульфата и хондроитина сульфата должно быть не менее 10,0.

На хроматограмме стандартного раствора В:

- отношение максимум/минимум (p/v) между суммарным пиком дерматана сульфата и хондроитина сульфата и пиком гепарина должно быть не менее 1,3;

- относительное стандартное отклонение площади пика гепарина должно быть не более 5,0% (6 введений).

Допустимое содержание примесей. На хроматограмме испытуемого раствора Б:

- площадь суммарного пика дерматана сульфата и хондроитина сульфата не должна превышать площадь соответствующего суммарного пика на хроматограмме стандартного раствора Б (не более 2,0%);

- сумма площадей пиков любых других примесей не должна превышать более чем в 0,01 раз площади пиков дерматансульфата и хондроитинсульфата на хроматограмме стандартного раствора Б (не более 0,02%);

- не учитывают пики, которые появляются во время начального изократического шага.

Гиперсульфатированный хондроитин сульфат. Определение проводят в условиях испытания "Подлинность. ¹H-ЯМР-спектроскопия".

Анализ ¹H ЯМР спектров. В диапазоне 1,5 - 3,0 м.д. не допускается присутствие характерного для гиперсульфатированного хондроитинсульфата сигнала при 2,16 +/- 0,03 м.д.

Азот. От 1,5 до 2,5% в пересчете на сухое вещество (ОФС "Определение азота в органических соединениях методом Кьельдаля"). Для определения используют 0,1 г (точная навеска) субстанции.

Натрий. От 9,5 до 13,5% в пересчете на сухое вещество. Определение проводят методом ААС (ОФС "Атомно-абсорбционная спектрометрия").

Раствор цезия хлорида. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 1,27 г цезия хлорида, растворяют в хлористоводородной кислоты растворе 0,1 М и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 50 мг (точная навеска) субстанции, растворяют в растворе цезия хлорида и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.

Калибровочные растворы натрия. В каждую из трех мерных колб вместимостью 100 мл помещают по 12,5 мл, 25,0 мл и 37,5 мл раствора натрия 200 мкг/мл (ОФС "Атомно-абсорбционная спектрометрия") и доводят объем раствора раствором цезия хлорида до метки.

Определяют значения атомной абсорбции испытуемого раствора и калибровочных растворов. По калибровочной кривой рассчитывают концентрацию натрия в субстанции.

Сульфатная зола. От 30% до 43% (ОФС "Сульфатная зола"). Для определения используют 0,5 г (точная навеска) субстанции.

Потеря в массе при высушивании. Не более 8,0% (ОФС "Потеря в массе при высушивании", способ 1). Сушат 1 г (точная навеска) субстанции над фосфора(V) оксидом при температуре 60 +/- 2 °C и остаточном давлении не более 0,67 кПа (5 мм рт. ст.) в течение 3 ч.

Тяжелые металлы. Не более 0,003%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Тяжелые металлы" (метод 3Б) с использованием 3,0 мл эталонного раствора 2.

Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС "Остаточные органические растворители".

<**> Бактериальные эндотоксины. Не более 0,01 ЕЭ/МЕ гепарина (ОФС "Бактериальные эндотоксины").

<**> Аномальная токсичность. Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС "Аномальная токсичность"). Тест-доза - 100 МЕ гепарина в 0,5 мл натрия хлорида растворе 0,9% для инъекций на мышь, внутривенно. Срок наблюдения - 48 ч.

<**> Стерильность. Субстанция должна быть стерильной (ОФС "Стерильность").

<**> Испытание на депрессорные вещества. Субстанция не должна обладать депрессорным действием (ОФС "Испытание на депрессорные вещества"). Тест-доза - 5000 МЕ гепарина в 1,0 мл натрия хлорида раствора 0,9% для инъекций на 1 кг массы животного.

--------------------------------

<**> Испытание проводят для субстанции, предназначенной для производства лекарственных препаратов для парентерального применения.

Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС "Микробиологическая чистота".

Анти-IIa активность. Проводят определение анти-IIa активности в соответствии с ОФС "Методы количественного определения гепарина" (определение анти-IIa активности НФГ).

Результаты испытания считаются достоверными, если измеренное значение анти-IIa активности субстанции составляет не менее 90% и не более 111% от предполагаемой активности.

Под предполагаемой активностью подразумевают значение активности субстанции, которое используют при расчетах необходимых разбавлений растворов субстанции, используемых при выполнении испытания. В случае невыполнения данного требования необходимо провести повторное испытание со скорректированным соответствующим образом значением предполагаемой активности субстанции и ее разведениями.

Доверительный интервал измеренной активности (P = 0,95) должен составлять от 80% до 125% от измеренной активности.

В герметично укупоренной упаковке. Если вещество стерильно, контейнер тоже должен быть стерилен.