"МУК 4.1.3991-24. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств спиропидиона в картофеле, сое (зерно, масло), бахчевых (огурцы/цуккини, дыня/арбуз) и овощных культурах (томаты, перец, баклажан) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.02.2024)

Разработаны "ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (С.В. Кузьмин, Т.А. Синицкая, Н.Е. Федорова, М.С. Гречина, В.В. Белицкая).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 19 февраля 2024 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) описывают порядок применения высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектированием для определения в картофеле, сое (зерно, масло), бахчевых (например, огурцы/цуккини, дыня/арбуз) и овощных культурах (например, томаты, перец, баклажан) массовой концентрации спиропидиона в диапазоне: 0,01 - 0,50 мг/кг - без разбавления и 0,01 - 25,00 мг/кг - с учетом разбавления в 50 раз.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Спиропидион - [3-(4-[хлор-2,6-диметилфенил)-8-метокси-1-метил-2-оксо-1,8-диазаспиро[4,5]дек-3-ен-4-ил]этил карбонат <1>. Брутто-формула C₂₁H₂₇ClN₂O₅. Молекулярная масса 422,9 г/моль.

--------------------------------

<1> В соответствии с классификацией Международного союза теоретической и прикладной химии (ИЮПАК) (англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Физические и химические свойства.

Порошок белого цвета без выраженного запаха.

2.3. Краткая токсикологическая характеристика.

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс (самки) > 2000 мг/кг, острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс (самцы, самки) > 5000 мг/кг. Острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс (самцы и самки) > 1120 мг/м³.

2.4. Новый инсектицидный активный ингредиент группы тетраминовых кислот рекомендован к применению на широком спектре сельскохозяйственных культур и эффективен в отношении паутинных клещей, тли, белокрылки и иных сосущих насекомых-вредителей.

3.1. При соблюдении условий проведения анализа <2> и методики, изложенных в настоящих МУК, погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

--------------------------------

<2> ГОСТ Р ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-2 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-3 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-4 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-5 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст (далее - ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

4.1. Измерения концентраций спиропидиона выполняют методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием.

4.2. Экстракцию вещества из анализируемых проб выполняют смесью ацетонитрила с водой в соотношении 8:2 или чистым ацетонитрилом (соя и соевое масло). В качестве дополнительной очистки используют вымораживание (соя и соевое масло). Перед измерением экстракт фильтруют через мембранный фильтр.

4.3. Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 5 пг. Средняя полнота извлечения - 93,5% (картофель), 93,1% (соя), 86,5% (соевое масло), 91,7% (арбузы), 94,0% (огурцы), 90,2% (баклажаны), 92,1% (перец), 92,7% (томаты).

4.4. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организуется обучение работников безопасности труда.

6.3. Работа с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см³), осуществляется в соответствии с законодательством Российской Федерации <3>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<3> Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением, утвержденные приказом Федеральной службы по экологическому, технологическому и атомному надзору от 15.12.2020 N 536 (зарегистрировано Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 - 30 °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на ВЭЖХ проводят в условиях, рекомендованных технической документацией на прибор.

8.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: подготовка подвижной фазы, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление смеси растворителей для разбавления градуировочных растворов и проведения экстракции, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, отбор и подготовка проб.

8.2. Приготовление 0,2%-го раствора муравьиной кислоты в воде (компонент А подвижной фазы).

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ деионизированной воды, вносят 2,0 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают. При необходимости приготовленный раствор дегазируют. Компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в стеклянной емкости) не более 14 дней.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ.

Промывают колонку подвижной фазой при соотношении компонентов А и Б (компонент А - 0,2%-й раствор муравьиной кислоты в воде, компонент Б - ацетонитрил) 1:1 и скорости подачи растворителя 0,3 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.4. Приготовление смеси растворителей для разбавления градуировочных растворов.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают с помощью мерного цилиндра 500 см³ ацетонитрила, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают. Раствор готовят при температуре плюс 20 °C и хранят в герметично закрытой стеклянной емкости не более 14 дней.

8.5. Приготовление смеси растворителей для экстракции.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают с помощью мерного цилиндра 200 см³ воды, доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают. Раствор готовят при температуре плюс 20 °C и хранят в герметично закрытой стеклянной емкости не более 14 дней.

8.6. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.6.1. Исходный раствор спиропидиона для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0005) г спиропидиона, растворяют в 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор готовят при температуре плюс 20 °C и хранят в герметично закрытой таре в холодильнике при температуре плюс 2 - 6 °C не более 6 месяцев.

Растворы N 1 - 8 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

8.6.2. Раствор N 1 спиропидиона для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора спиропидиона с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 8.6.1), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4, тщательно перемешивают. Градуировочный раствор N 1 готовят при температуре плюс 20 °C и хранят в холодильнике в герметично закрытой таре при температуре плюс 2 - 6 °C не более месяца.

8.6.3. Растворы N 2 - 3 спиропидиона для градуировки и внесения (концентрация 1,0 и 0,1 мкг/см³).

В две мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 10,0 и 1,0 см³ градуировочного раствора N 1 спиропидиона с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 8.6.2), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4, тщательно перемешивают. Градуировочные растворы N 2 и N 3 готовят при температуре плюс 20 °C и хранят в холодильнике в герметично закрытой таре при температуре плюс 2 - 6 °C не более месяца.

Растворы N 1 - 3 используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

8.6.4. Рабочие растворы N 4 - 8 спиропидиона для градуировки (концентрация 0,001 - 0,05 мкг/см³).

В 2 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 5,0 и 10 см³ градуировочного раствора N 2 с концентрацией спиропидиона 1 мкг/см³ (п. 8.6.3), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 4 - 5 с концентрацией спиропидиона 0,05 и 0,01 мкг/см³ соответственно.

В 3 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 5,0; 2,0 и 1,0 см³ градуировочного раствора N 3 с концентрацией спиропидиона 0,1 мкг/см³ (п. 8.6.3), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по 8.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 6 - 8 с концентрацией спиропидиона 0,005; 0,002 и 0,001 мкг/см³ соответственно.

Растворы готовят при температуре плюс 20 °C и хранят в холодильнике при температуре плюс 2 - 6 °C не более недели.

8.7. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации спиропидиона в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм³ каждого градуировочного раствора (рабочие растворы N 4 - 8) спиропидиона и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

8.8. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

Проводят измерения не менее двух образцов растворов для градуировки, содержание спиропидиона в которых должно входить в диапазон концентраций от 0,001 до 0,05 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение (1), (2):

где A - величина расхождения, %;

X - концентрация вещества в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, % (равен 20% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 20%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов спиропидиона, предусмотренных настоящими МУК. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново в соответствии с п. 8.7.

9.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с методическими документами <4>.

--------------------------------

<4> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79; ГОСТ 33932 "Огурцы свежие, реализуемые в розничной торговле. Технические условия", введенный приказом Росстандарта от 29.11.2016 N 1849-ст; ГОСТ 7176 "Картофель продовольственный. Технические условия", введенный приказом Росстандарта от 28.11.2017 N 1843-ст; ГОСТ 34298 "Томаты свежие. Технические условия", введенный приказом Росстандарта от 14.12.2017 N 1956-ст; ГОСТ 34325 "Перец сладкий свежий. Технические условия", введенный приказом Росстандарта от 14.12.2017 N 1978-ст; ГОСТ 31821 "Баклажаны свежие, реализуемые в розничной торговле. Технические условия", введенный приказом Росстандарта от 30.05.2022 N 426-ст; ГОСТ 7177 "Арбузы продовольственные свежие. Технические условия", введенный приказом Росстандарта от 30.05.2022 N 425-ст; ГОСТ 17109 "Соя. Требования при заготовках и поставках", введенный Постановлением Росстандарта СССР от 30.09.1988 N 302; ГОСТ 31760 "Масло соевое. Технические условия", введенный приказом Госстандарта от 29.11.2012 N 1630-ст.

9.2. Растительные пробы хранят при температуре плюс 2 - 6 °C не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C. Масло хранят при температуре плюс 2 - 6 °C в течение месяца. Перед анализом растительные образцы измельчают, масло тщательно перемешивают.

10.1. Картофель, бахчевые и овощные культуры.

Гомогенизированный образец массой 10 г помещают в химический стакан на 250 см³, заливают 50 см³ смеси, приготовленной по п. 8.5. Помещают стакан на аппарат для встряхивания на 30 мин. После отстаивания отбирают аликвоту экстракта (около 10 см³), помещают в полипропиленовую пробирку на 15 см³ и центрифугируют 3 мин при скорости вращения не менее 4000 об/мин.

После центрифугирования аликвоту надосадочной жидкости разбавляют смесью, приготовленной по п. 8.5, в 2 раза. Для этого отбирают 1 см³ экстракта с помощью пипетки на 1 см³ в чистую полипропиленовую пробирку на 15 см³ и разбавляют 1 см³ смеси, тщательно перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,20 мкм) в виалу и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3.

10.2. Соя, соевое масло.

Образец измельченных семян сои или соевого масла массой 5 г помещают в химический стакан на 250 см³, заливают 50 см³ ацетонитрила. Помещают стакан на аппарат для встряхивания на 30 мин. После отстаивания раствора (полного расслоения фаз в случае анализа масла) отбирают с помощью пипетки аликвоту (около 10 см³) надосадочной жидкости (или верхнего ацетонитрильного слоя), переносят в полипропиленовую пробирку на 15 см³ и помещают в морозильную камеру (ларь) на 2 - 2,5 часа при температуре не выше минус 18 °C. Полученный холодный образец центрифугируют 2 мин при скорости вращения 4000 об/мин. Затем очищенный экстракт фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,20 мкм) в виалу и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3.

10.3. Измерения выполняют на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации электроспрей (англ. Electrospray Ionization, ESI) при регистрации дочерних положительных ионов после разрушения материнских (регистрация "перехода"). Режим работы: мониторинг множественных реакций (англ. Multiple Reaction Monitoring, MRM).

Параметры масс-спектрометрического детектора <5>:

- материнский ион (масса/заряд): 423,17;

- дочерние ионы (масса/заряд): 288 (количественный расчет), 264, 128;

- напряжение на фрагментаторе, В: 104;

- энергия разрушения (соударения), В: 26 (423,17 -> 288), 38 (423,17 -> 264), 102 (423,17 -> 128);

- скорость сканирования: 200 мс;

- давление на распылителе: 35 psi.

Скорость газа распыления (азот): 12 дм³/мин.

Скорость осушающего газа (азот): 10 дм³/мин.

Температура осушающего газа: плюс 350 °C.

Условия хроматографирования:

- хроматографическая колонка стальная, длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм;

- температура колонки: плюс 30 °C;

- скорость потока элюента: 0,3 см³/мин;

- объем вводимой пробы: 5 мм³;

- подвижная фаза: 0,2%-й раствор муравьиной кислоты в воде - ацетонитрил (40:60, по объему).

Линейный диапазон детектирования 5 - 250 пг.

--------------------------------

<5> Примечание: параметры масс-спектрометрического детектора могут различаться в зависимости от марки и модели прибора.

11.1. Содержание спиропидиона в образцах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле (3):

где A - концентрация спиропидиона, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстрагента, см³ (50 см³);

m - масса анализируемого образца, г (5 г - соя, соевое масло, 10 г - другие матрицы);

C - коэффициент, учитывающий разбавление экстракта при подготовке пробы (C = 1 - соя, соевое масло, C = 2 - другие матрицы);

K_р - коэффициент дополнительного разбавления при превышении концентрации верхнего градуировочного уровня (если экстракт подвергался разбавлению).

Примечание: идентификация и расчет концентрации веществ в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

11.2. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости и удовлетворяет условие (4):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия (4) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат количественного анализа представляют в виде формулы (5):

где - среднее арифметическое результатов определений, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг, рассчитанная по формуле (6):

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности по диапазону концентраций, табл. 3.1), %.

Результат измерений должен иметь тот же десятичный разряд, что и погрешность.

Если содержание вещества менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание спиропидиона в картофеле, сое (зерно, масло), бахчевых (огурцы/цуккини, дыня/арбуз) и овощных культурах (томаты, перец, баклажан) - менее 0,01 мг/кг". <6>

--------------------------------

<6> Примечание: 0,01 мг/г - предел обнаружения спиропидиона в картофеле, сое (зерно, масло), бахчевых (огурцы/цуккини, дыня/арбуз) и овощных культурах (томаты, перец, баклажан).

13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с методическими документами <7>. Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

--------------------------------

<7> ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением.

3. ГОСТ Р ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения".

4. ГОСТ Р ИСО 5725-2 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений".

5. ГОСТ Р ИСО 5725-3 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений".

6. ГОСТ Р ИСО 5725-4 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений".

7. ГОСТ Р ИСО 5725-5 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений".

8. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

9. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

10. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

11. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

12. ГОСТ OIML R 111-1 "Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

13. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

14. ГОСТ ISO 7886-1 "Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования".

15. ГОСТ 5848 "Кислота муравьиная. Технические условия".

16. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

17. ГОСТ 26678 "Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия".

18. ГОСТ 9293 "Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

19. ГОСТ 12.1.007 "Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

20. ГОСТ 12.1.019 "Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

21. ГОСТ 12.1.004 "Пожарная безопасность. Общие требования".

22. ГОСТ 12.4.009 "Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

23. ГОСТ 33932 "Огурцы свежие, реализуемые в розничной торговле. Технические условия".

24. ГОСТ 7176 "Картофель продовольственный. Технические условия".

25. ГОСТ 34298 "Томаты свежие. Технические условия".

26. ГОСТ 34325 "Перец сладкий свежий. Технические условия".

27. ГОСТ 31821 "Баклажаны свежие, реализуемые в розничной торговле. Технические условия".

28. ГОСТ 7177 "Арбузы продовольственные свежие. Технические условия".

29. ГОСТ 17109 "Соя. Требования при заготовках и поставках".

30. ГОСТ 31760 "Масло соевое. Технические условия".

31. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов.