"МУК 4.2.3599-20. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Pichia pastoris (Komagataella kurtzmanii) БРЦ ВКПМ Y-4465 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 03.07.2020)

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Pichia pastoris (Komagataella kurtzmanii) БРЦ ВКПМ Y-4465 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль микробиологического загрязнения воздушной среды, а также санитарных лабораторий биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий, научно-исследовательских организаций, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на проведение микробиологических исследований.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Штамм Pichia pastoris БРЦ ВКПМ Y-4465 <1>, который получен трансформацией фрагмента ДНК, включающего ген, кодирующий , предполагается использовать в промышленном производстве фермента для кормовых целей.

--------------------------------

<1> Штамм Pichia pastoris депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика под номером БРЦ ВКПМ Y-4465.

При культивировании при температуре 28 °C в течение 48 часов на глюкозо-пептон-дрожжевом агаре (далее - YPD) клетки штамма диаметром 3 - 4 мкм имеют овальную форму. Клетки почкуются, истинного мицелия не образуют.

На агаризованной среде YPD - колонии светло-бежевого цвета, с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.

При росте штамма в жидкой среде YPD при 28 °C в течение 24 ч жидкость становится мутной, появляется белый осадок, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок штамм не образует.

Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (г/1000 см³): хлорид калия - 1,0, ацетат натрия - 0,5, глюкоза - 1,0, агар - 2,0, вода - 95,5. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспоры.

Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях. В качестве единственного источника углерода способен использовать метанол, этанол, глюкозу, глицерин, лактат, сукцинат, не способен ассимилировать мальтозу, сахарозу, ацетат, крахмал, лактозу. Штамм не способен к росту при 35 °C. Штамм не способен к ассимиляции трегалозы.

Штамм Pichia pastoris БРЦ ВКПМ Y-4465 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека <2>. Работа со штаммом Pichia pastoris БРЦ ВКПМ Y-4465 не требует специальных мер предосторожности.

--------------------------------

<2> Согласно классификации микроорганизмов, приведенной в санитарно-эпидемиологических правилах СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней" (далее - СП 1.3.2322-08).

3.1. Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4.1. Метод основан на аспирации из атмосферного воздуха городских и сельских поселений клеток псевдомицелия и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в таблицах 1 - 3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6.1. При выполнении измерений концентрации клеток гриба в атмосферном воздухе городских и сельских поселений необходимо соблюдать санитарно-эпидемиологические требования <3> и правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005.

--------------------------------

<3> СП 1.3.2322-08.

6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

7.1. Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

8.1. Для приготовления глюкозо-пептон-дрожжевого агара используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1000 см³): пептон - 20,0 г, глюкоза - 20,0 г, дрожжевой экстракт - 10,0 г, агар-агар - 20,0 г, дистиллированная вода - 1000 см³.

8.2. Сухие компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

8.3. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.

8.4. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C в течение не более 10 дней.

9.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с методическими документами <4>.

--------------------------------

<4> МУК 4.2.1054-01 "Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест" и ГОСТ Р 8.563 "Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Методики (методы) измерений".

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (YPD) расплавляют, остужают до 50 - 60 °C и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методами контроля <5>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °C не более 10 дней.

--------------------------------

<5> Пункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред" (далее - МУК 4.2.2316-08).

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой 28 +/- 2 °C. Через 1 - 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с ростовыми свойствами питательных сред <6>. Для этого музейный штамм Pichia pastoris БРЦ ВКПМ Y-4465 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

--------------------------------

<6> МУК 4.2.2316-08.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

10.1. Расчет концентрации клеток производят по формуле:

где К - концентрация штамма в воздухе, клеток/м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета дм³ на м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, дм³/мин;

T - время аспирации, мин.

11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, приведенным в приложении к МУК.