"МУК 4.2.3566-19. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.10.2019)

1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 24 октября 2019 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 5 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль микробиологического загрязнения воздушной среды, а также санитарных лабораторий биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий, научно-исследовательских организаций, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на проведение микробиологических исследований.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

2.1. Штамм Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394, включающий рекомбинантный фрагмент ДНК, предполагается использовать в промышленном производстве фермента ксиланазы для кормовых целей.

Мезофил. Хороший рост штамма наблюдается через 24 часа при 25 - 28 °C на глюкозо-пептонном агаре (ГПА).

Штамм растет также на агаризованных средах: глюкозо-пептон-дрожжевом агаре (YPD), глицерин-пептон-дрожжевом агаре (YPG), мясопептонном агаре (МПА), АГВ среде, картофельный агаре (КА).

При росте на агаризованной среде образуются гладкие, округлые колонии с матовой поверхностью светло-бежевого цвета, край ровный. При росте в жидкой среде клетки образуют ровную интенсивную муть, пристеночных пленок не образуют, наблюдается белый осадок, коагуляция отсутствует.

На среде YPD штамм образует клетки округлой, слегка овальной формы размером 3 - 4 мкм, клетки почкуются, почкование многостороннее, истинного мицелия не образуют.

Штамм Komagataella (Pichia) pastoris депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером БРЦ ВКПМ Y-4394.

Штамм Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенных в санитарных правилах <1>. Работа со штаммом Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 не требует специальных мер предосторожности.

--------------------------------

<1> СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

Предельно допустимая концентрация (ПДК) Komagataella (Pichia) pastoris в атмосферном воздухе установлена в гигиенических нормативах <2>.

--------------------------------

<2> ГН 2.1.6.3537-18 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе городских и сельских поселений".

3.1. Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 5 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4.1. Метод основан на аспирации из атмосферного воздуха городских и сельских поселений клеток псевдомицелия и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6.1. Измерение концентрации клеток гриба в атмосферном воздухе городских и сельских поселений осуществляется в соответствии с санитарными правилами <3>. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами регламентируются ГОСТ 12.1.005, электробезопасность при работе с электроустановками - ГОСТ 12.1.019 и инструкцией - по эксплуатации прибора.

--------------------------------

<3> СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

6.2. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованным бактерицидными лампами.

7.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним профессиональным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8.1. Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление 760 +/- 20 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80%.

9.1. Для приготовления глюкозо-пептон-дрожжевого агара используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1 000 см³): пептон - 10,0 г, глюкоза - 10,0 г, дрожжевой экстракт - 10,0 г, агар-агар - 15,0 г, дистиллированная вода - 1 000 см³.

Сухие компоненты растворяют в 1 000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C не более 10 дней.

10.1. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02 и ГОСТ Р 8.563.

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с Инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (YPD) расплавляют, остужают до 50 - 60 °C и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методическими указаниями <4>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °C не более 10 дней.

--------------------------------

<4> Пункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28 +/- 2) °C. Через 1 - 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии методическими указаниями <5>. Для этого эталонный музейный штамм Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

--------------------------------

<5> МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

11.1. Расчет концентрации клеток производят по формуле:

К - концентрация штамма в воздухе, кл./м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

T - время аспирации, мин.

12.1. По окончании измерения и расчета концентрации клеток микроорганизма в воздухе должен быть составлен протокол (отчет), в котором представлена необходимая информация:

- о месте отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы);

- о марке пробоотборника, который использовался исследователями, питательной среде и времени инкубации;

- о лицах, производивших отбор проб воздуха, идентификацию штамма и расчет концентрации штамма.

Основные качественные и количественные параметры измерения представляются в виде табл. 4.