"МУК 4.1.3870-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флуоксапипролина с учетом основного метаболита BCS-CS55621-BDM-pyrazole (BCS-BP32808) в воде и флуоксапипролина в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 23.06.2023)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (Кузьмин С.В., Синицкая Т.А., Федорова Н.Е., Гречина М.С., Белицкая В.В.).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 23 июня 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для определения в воде массовой концентрации флуоксапипролина и его метаболита BCS-BP32808 в диапазоне (0,0001 - 0,005) мг/дм³ - без разбавления, (0,0001 - 0,25) мг/дм³ - с учетом разбавления в 50 раз; для определения в почве массовой концентрации флуоксапипролина в диапазоне (0,005 - 0,25) мг/кг без разбавления, (0,005 - 12,5) мг/кг - с учетом разбавления в 50 раз.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Флуоксапипролин - 2-{(5RS)-3-[2-(1-{[3,5-бис(дифлуорометил)-1Н-пиразол-1-ил] ацетил}пиперидин-4-ил)-1,3-тиазол-4-ил]-4,5-дигидро-1,2-оксазол-5-ил}-3-хлорфенил метансульфонат <1>. Брутто-формула C₂₅H₂₄ClF₄N₅O₅S₂. Молекулярная масса 649,1 г/моль.

2.2. Физические и химические свойства. Светло-бежевый порошок со слабым нехарактерным запахом. Давление паров менее 3,0·10^-5 мПа (при плюс 20 °C). Растворимость в органических растворителях (при плюс 20 °C, г/дм³): гептан - 0,061, ацетон - 84, метанол - 1,3, толуол - 1,1, октанол - 17, дихлорметан - 143, этилацетат - 15, диметилсульфоксид > 270. Растворимость в воде при плюс 20 °C - 0,08 мг/дм³. Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода при 25 °C: K_ow logP = 3,4.

2.3. Острая пероральная токсичность для крыс и мышей (ЛД₅₀) 2000 мг/кг, острая дермальная токсичность (ЛД₅₀) > 2000 мг/кг. Острая ингаляционная токсичность (ЛК₅₀) для крыс выше 2,11 мг/л.

2.4. Новый фунгицид, обеспечивающий защиту плодовых культур и винограда от широкого спектра болезней.

2.5. BCS-CS55621-BDM-pyrazole (BCS-BP32808) - 3,5-бис(дифторметил)-1Н-пиразол <1>. Брутто-формула C₅H₄F₄N₂. Молекулярная масса 168,1 г/моль. Метаболит флуоксапипролина.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Измерения концентраций флуоксапипролина и его метаболита BCS-BP32808 выполняют методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

4.2. Очистку и концентрирование проб воды проводят на патронах для твердофазной экстракции с гидрофильно-липофильным сорбентом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола. Экстракцию вещества из почвы выполняют смесью ацетонитрила с водой (4:1). Дополнительно проводят очистку экстрактов с помощью мембранных шприцевых фильтров с размером пор не более 0,20 мкм.

4.3. Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 5 пг.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в таблицах 5.1 - 5.3.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<2> Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением, утвержденные приказом Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 (зарегистрировано Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментальное соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (15 - 30) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией на прибор.

8.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: подготовка подвижной фазы, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление смеси растворителей для экстракции и разбавления рабочих растворов, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочных характеристик, подготовка патронов для твердофазной экстракции, отбор и подготовка проб.

8.2. Приготовление растворов муравьиной кислоты.

8.2.1. Приготовление 0,1%-ного раствора муравьиной кислоты в воде (компонент А подвижной фазы).

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ деионизированной воды, вносят 1,0 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают. При необходимости приготовленный раствор дегазируют. Компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14-ти дней.

8.2.2. Приготовление 2%-ного раствора муравьиной кислоты в воде.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 50 см³ деионизированной воды, вносят 2,0 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают. Хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14-ти дней.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ.

Промывают колонку подвижной фазой при соотношении компонентов А и Б (компонент А - 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде, компонент Б - ацетонитрил) 1:1 и скорости подачи растворителя 0,3 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.4. Приготовление смеси растворителей для экстракции и разбавления рабочих растворов.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают с помощью мерного цилиндра 800 см³ ацетонитрила, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают. Раствор хранят в герметично закрытой стеклянной емкости не более 14-ти дней.

8.5. Подготовка к работе патронов (картриджей) для твердофазной экстракции.

Патроны устанавливают на манифолд, последовательно промывают 2 см³ метанола и 2 см³ деионизированной воды. Процедуру проводят с использованием вакуума. Скорость элюирования - 2 - 5 см³/мин в минуту. Картриджи готовят непосредственно перед использованием.

8.6. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.6.1. Исходные растворы флуоксапипролина и его метаболита BCS-BP32808 для градуировки (концентрация 100 мкг/см³).

В две мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают раздельно по (0,0100 +/- 0,0005) г флуоксапипролина и BCS-BP32808, растворяют в 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Растворы хранят в герметично закрытой таре в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более месяца.

Растворы N 1 - 7 и N 1' - 7' готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходным раствором для градуировки.

8.6.2. Раствор N 1 флуоксапипролина и раствор N 1' метаболита BCS-BP32808 для градуировки и внесения (концентрация 1 мкг/см³).

В две мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают раздельно по 1 см³ исходных растворов флуоксапипролина и BCS-BP32808 с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 8.6.1), разбавляют ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают. Градуировочные растворы N 1 и N 1' хранят в холодильнике в герметично закрытой таре при температуре плюс (2 - 6) °C не более месяца.

8.6.3. Раствор N 2 флуоксапипролина и раствор N 2' метаболита BCS-BP32808 для градуировки и внесения (концентрация 0,1 мкг/см³).

В две мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают раздельно по 10 см³ градуировочных растворов N 1 флуоксапипролина и N 1' метаболита BCS-BP32808 с концентрацией 1 мкг/см³ (п. 8.6.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают. Градуировочные растворы N 2 и N 2' хранят в холодильнике в герметично закрытой таре при температуре плюс (2 - 6) °C не более двух недель.

Растворы N 1, N 2, N 1' и N 2' используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения веществ методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

8.6.4. Рабочие растворы N 3 - 7 флуоксапипролина для градуировки (концентрация 0,001 - 0,05 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 5 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией флуоксапипролина 1 мкг/см³ (п. 8.6.2), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 3 с концентрацией флуоксапипролина 0,05 мкг/см³.

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 10,0; 5,0; 2,0 и 1,0 см³ градуировочных растворов N 2 с концентрацией флуоксапипролина 0,1 мкг/см³ (п. 8.6.3), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 4 - 7 с концентрацией флуоксапипролина 0,01; 0,005; 0,002; 0,001 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более 1 недели.

8.6.5. Рабочие растворы N 3' - 7' метаболита BCS-BP32808 для градуировки (концентрация 0,001 - 0,05 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 5 см³ градуировочного раствора N 1' с концентрацией BCS-BP32808 1 мкг/см³ (п. 8.6.2), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 3' с концентрацией BCS-BP32808 0,05 мкг/см³.

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 10,0; 5,0; 2,0 и 1,0 см³ градуировочного раствора N 2' с концентрацией BCS-BP32808 0,1 мкг/см³ (п. 8.6.3), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы NN 4' - 7' с концентрацией BCS-BP32808 0,01; 0,005; 0,002 и 0,001 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более 1 недели.

8.7. Установление градуировочных характеристик.

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площадей пиков от концентраций флуоксапипролина и его метаболита BCS-BP32808 в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм³ каждого градуировочного раствора (N 4 - N 7) для флуоксапипролина и (N 4' - N 7') для метаболита BCS-BP32808 и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3. Осуществляют не менее 5-ти параллельных измерений. Устанавливают площади пиков флуоксапипролина и его метаболита BCS-BP32808.

8.8. Контроль стабильности градуировочных характеристик.

Контроль стабильности градуировочных характеристик проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

Проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание флуоксапипролина и его метаболита BCS-BP32808 в которых должно входить в диапазон концентраций от 0,001 до 0,05 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где A - величина расхождения, %;

X - концентрация вещества в растворе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 20% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 20%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флуоксапипролина и его метаболита BCS-BP32808, предусмотренных методикой измерения. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 8.7.

9.1. Отбор проб осуществляется в соответствии с методическими документами <3>.

--------------------------------

<3> ГОСТ Р 59024 "Национальный стандарт Российской Федерации. Вода. Общие требования к отбору проб", утвержден и введен в действие Приказом Росстандарта от 10.09.2020 N 640-ст; ГОСТ 17.4.3.01 "Государственный стандарт Российской Федерации. Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб", введен в действие Приказом Росстандарта от 01.06.2018 N 302-ст; ГОСТ Р 58595 "Национальный стандарт Российской Федерации. Почвы. Отбор проб", утвержден и введен в действие Приказом Росстандарта от 10.10.2019 N 954-ст.

9.2. Пробы воды отбирают и хранят в бутылях из полиэтилена (полипропилена) при температуре плюс 2 - 6 °C не более недели. При отборе допускается консервация азотной кислотой до pH 3. Пробы почвы (предварительно подсушивают) и хранят при комнатной температуре не более 2-х недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.

Перед анализом образцы размораживают.

10.1. Вода.

Очистку и концентрирование проб воды проводят на концентрирующих патронах (картриджах). Образец воды объемом 40 см³ пропускают через картридж, подготовленный по п. 8.5, со скоростью прохождения раствора 1 - 2 см³/мин, пропуская раствор до верхнего края сорбента. После нанесения пробы, патрон дополнительно промывают 2 см³ раствора, приготовленного по п. 8.2.2, и удаляют остатки водного раствора под вакуумом. Флуоксапипролин и его метаболит BCS-BP32808 элюируют 4 см³ метанола (последовательно 2 раза по 2 см³), тщательно перемешивают и анализируют при условиях хроматографирования, указанных в п. 10.3.

10.2. Почва.

Образец массой 5 г помещают в полипропиленовую пробирку на 50 см³, заливают 25 см³ смеси растворителей, приготовленной по п. 8.4, перемешивают и помещают на аппарат для встряхивания на 30 минут. После встряхивания пробу центрифугируют в течение 3 мин при скорости вращения 4000 оборотов/мин. Часть надосадочной жидкости фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,20 мкм) в виалу и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3.

10.3. Измерения выполняют на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации электроспрей (ESI) при регистрации дочерних положительных ионов (флуоксапипролин) и отрицательных ионов (метаболит BCS-BP32808) после разрушения материнских (регистрация "перехода"). Режим работы: мониторинг множественных реакций (MRM).

Рекомендуемые параметры масс-спектрометрического детектора:

Материнский ион (масса/заряд): 650,09

Дочерние ионы (масса/заряд): 157,1 (количественный расчет), 193,1

Напряжение на фрагментаторе, В: 137

Энергия разрушения (соударения), В: 61 (650,09 -> 157,1), 37 (650,09 -> 193,1)

Материнский ион (масса/заряд): 167,02

Дочерние ионы (масса/заряд): 146,9 (количественный расчет), 126,9

Напряжение на фрагментаторе, В: 81

Энергия разрушения (соударения), В: 13 (167,02 -> 146,9), 21 (167,02 -> 126,9)

Скорость сканирования: 200 мс

Давление на распылителе: 35 psi

Скорость газа распыления (азот): 12 дм³/мин

Скорость осушающего газа (азот): 10 дм³/мин

Температура осушающего газа: плюс 350 °C.

Условия хроматографирования:

- хроматографическая колонка стальная, длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм;

- температура колонки: плюс 40 °C;

- скорость потока элюента: 0,3 см³/мин;

- объем вводимой пробы: 5 мм³;

- подвижная фаза: 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде - ацетонитрил (40:60, по объему).

Линейный диапазон детектирования 5 - 250 пг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 0,05 мкг/см³, разбавляют смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4 (не более чем в 50 раз).

11.1. Содержание флуоксапипролина с учетом его метаболита BCS-BP32808 в пробах воды (X, мг/дм³) рассчитывают по формуле:

где Cф (Cм) - концентрация флуоксапипролина (метаболита BCS-BP32808), найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

К - коэффициент пересчета содержания метаболита на эквивалент действующего вещества, равный 3,86 (по соотношению молекулярных масс);

V_кон - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³ (4 см³);

V - объем анализируемого образца, см³ (40 см³);

Кр - коэффициент разбавления (если экстракт подвергался разбавлению).

11.2 Содержание флуоксапипролина в почве (X', мг/кг) рассчитывают по формуле:

где C - концентрация флуоксапипролина, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V_кон - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³ (25 см³);

m - масса анализируемого образца, г (5 г);

Кр - коэффициент разбавления (если экстракт подвергался разбавлению).

Идентификация и расчет концентрации веществ в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

11.3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (таблица 3.1), при этом .

При невыполнении условия (4) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат количественного анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, мг/дм³, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/дм³, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности по диапазону концентраций, таблица 3.1), %.

Результат измерений должен иметь тот же десятичный разряд, что и погрешность.

Если содержание вещества менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

--------------------------------

<4> 0,0001 мг/дм³ - предел обнаружения флуоксапипролина и его метаболита BCS-BP32808 в воде; 0,005 мг/кг - предел обнаружения флуоксапипролина в почве.

13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6). Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением" (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

3. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Межгосударственный стандарт. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

4. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

5. ГОСТ 29227 "Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

6. ГОСТ 1770 "Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

7. ГОСТ OIML R 111-1 "Межгосударственный стандарт. Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

8. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

9. ГОСТ ISO 7886-1 "Межгосударственный стандарт. Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования".

10. ГОСТ 5848 "Государственный стандарт союза ССР. Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия".

11. ГОСТ 6995 "Государственный стандарт союза ССР. Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

12. ГОСТ 25336 "Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

13. ГОСТ 26678 "Государственный стандарт союза ССР. Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия".

14. ГОСТ 9293 (ИСО 2435) "Межгосударственный стандарт. Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

15. ГОСТ 12.1.007 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

16. ГОСТ 12.1.019 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

17. ГОСТ 12.1.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

18. ГОСТ 12.4.009 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

19. ГОСТ 12.0.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

20. ГОСТ 31861 "Межгосударственный стандарт. Вода. Общие требования к отбору проб".

21. ГОСТ 17.4.3.01 "Межгосударственный стандарт. Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб".

22. ГОСТ Р 58595 "Почвы. Отбор проб".

23. ГОСТ 27384 "Межгосударственный стандарт. Вода. Нормы погрешности измерений показателей состава и свойств".