"МУК 4.1.3873-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств спиродиклофена в воде, почве, зеленой массе, бобах и масле сои, плодах и соке яблок, ягодах и соке винограда и его метаболита спиродиклофен-енола в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 26.06.2023)

1. Разработаны ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений" (Черменская Т.Д., Цибульская И.А., Петрова М.О., Долженко В.И.); ООО "ИЦЗР" (Алексеев А.Ю.).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 июня 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения массовой концентрации спиродиклофена в воде в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/дм³, в почве, зеленой массе, бобах и масле сои, плодах и соке яблок, ягодах и соке винограда в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг, спиродиклофен-енола в почве в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Спиродиклофен.

3-(2,4-дихлорфенил)-2-оксо-1-оксаспиро[4.5]дец-3-ен-4-ил-2,2-диметилбутират.

Структурная формула приведена на рисунке 1.

Молекулярная масса: 411,3.

Брутто формула: C₂₁H₂₄Cl₂O₄.

Химически чистое вещество представляет собой белый порошок. Температура плавления 94,8 °C. Давление паров 3 x 10^-4 мПа (плюс 20 °C). Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода K_ow logP = 5,8 (плюс 20 °C, pH 4). Растворимость в воде (г/дм³, плюс 20 °C): 0,05 (pH 4), 0,19 (pH 7). Растворимость в органических растворителях (г/дм³, плюс 20 °C): в н-гептане - 20, изопропаноле - 47, дихлорметане, этилацетате, ацетоне, метаноле, ацетонитриле > 250. Гидролиз ДТ₅₀ 119,6 дней (pH 4), 52,1 день (pH 7), 2,5 дня (pH 9), все при плюс 20 °C. Период полураспада в почве ДТ₅₀ 0,5 - 5,5 дней, главный метаболит, образующийся путем де-этерификации, спиродиклофен-енол.

Селективный, несистемный акарицид, препятствует развитию клещей, ингибитор биосинтеза липидов. Используется против растительноядных клещей на винограде, плодовых и ягодных культурах.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность для крыс ЛД₅₀ > 2500 мг/кг, острая дермальная токсичность для крыс ЛД₅₀ > 2000 мг/кг, ингаляционная токсичность ЛК₅₀ (4 часа) > 5 мг/дм³. Не ирритант для кожи и глаз кроликов.

2.2. Спиродиклофен-енол.

3-(2,4-дихлорфенил)-4-гидрокси-1-оксаспиро[4.5]дец-3-ен-2-он.

Структурная формула приведена на рисунке 2.

Молекулярная масса: 313,2.

Брутто формула: C₁₅H₁₄Cl₂O₃.

3.1. При соблюдении всех условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 и 2, для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Метод основан на определении спиродиклофена и спиродиклофен-енола методом ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового детектора (далее - УФ-детектор) после извлечения из образцов ацетонитрилом и очистки ацетонитрильного экстракта на сорбенте. Для извлечения вещества из образцов воды используют переэкстракцию в гексан.

Идентификация спиродиклофена и спиродиклофен-енола проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

5.1. Средства измерений:

- жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки;

- весы лабораторные общего назначения, наибольший предел взвешивания 150 г, предел допустимой погрешности 5 мг, ГОСТ 53228;

- весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 81/210 г, предел допустимой погрешности 0,1/0,3 мг, ГОСТ 53228;

- дозаторы пипеточные переменного объема от 10 до 100 мм³ и от 100 до 1000 мм³, ГОСТ 28311;

- колбы мерные на 10, 100, 500 и 1000 см³, ГОСТ 1770;

- цилиндры мерные на 50 и 100 см³, ГОСТ 1770.

5.2. Реактивы:

- ацетонитрил для ВЭЖХ;

- вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная), ГОСТ Р 52501;

- н-Гексан, химически чистый;

- кислота ортофосфорная 98%, химически чистая, ГОСТ 6552;

- магний сернокислый безводный, 97%;

- натрий лимоннокислый двузамещенный, 1,5-водный, химический чистый;

- натрий лимоннокислый трехзамещенный, 2-водный, химический чистый;

- натрий сернокислый безводный, химически чистый, ГОСТ 4166;

- натрий хлористый, чистый для анализа, ГОСТ 4233;

- сорбент для твердофазной экстракции на основе силикагеля с привитыми N-пропилэтилендиаминными группами (PSA), средний размер частиц 50 мкм;

- спиродиклофен, с содержанием основного вещества 98,6%;

- спиродиклофен-енол, с содержанием основного вещества 99,2%.

5.3. Вспомогательные устройства и материалы:

- аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18 (50 x 2,1) мм, 1,7 мкм;

- вакуумный манипулятор для работы с патронами для твердофазной экстракции;

- воронки делительные 500 см³, ГОСТ 25336;

- воронки лабораторные, ГОСТ 25336;

- колбы круглодонные на шлифе вместимостью 25 и 100 см³, ГОСТ 25336;

- патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, объем 1 мл;

- пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 и 15 см³;

- ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар;

- стаканы химические вместимостью 150 см³, ГОСТ 25336;

- устройство перемешивающее (50 - 200 колебаний в мин);

- фильтры бумажные средней плотности;

- центрифуга со скоростью вращения 4000 об./мин.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на комплекс жидкостного хроматографа.

5.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов <1>. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

--------------------------------

<1> СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 2 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021 N 62296).

6.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

7.1. При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 20 +/- 5 °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Очистка органических растворителей.

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.

8.2. Кондиционирование колонки.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

8.3. Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции.

Патрон промывают 2,5 см³ смеси N 1, затем 3 см³ гексана.

8.4. Приготовление растворов.

8.4.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: 0,5 +/- 0,01 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в деионизованной воде и доводят объем до метки.

8.4.2. Для приготовления смеси N 1: гексан и этилацетат смешивают в соотношении 4:1 по объему, используя мерные цилиндры.

8.4.3. Для приготовления подвижной фазы для ВЭЖХ в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 650 см³ ацетонитрила и доводят до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

Растворы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.5. Приготовление основного и градуировочных растворов.

8.5.1. Основной раствор спиродиклофена с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску спиродиклофена (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

8.5.2. Основной раствор спиродиклофен-енола с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску спиродиклофен-енола (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

8.5.3. Приготовление градуировочных растворов спиродиклофена

Градуировочные растворы с концентрациями спиродиклофена 0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 и 0,25 мкг/см³ соответственно готовят методом последовательного разбавления по объему, используя подвижную фазу.

8.5.3.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора спиродиклофена и доводят до метки подвижной фазой.

8.5.3.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,25 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ вносят 2,5 см³ раствора N 1 и доводят до метки подвижной фазой.

8.5.3.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

8.5.3.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

8.5.3.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,025 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

8.5.3.6. Раствор N 6 с концентрацией 0,0125 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора N 5 и доводят объем до метки подвижной фазой.

8.5.4. Приготовление градуировочных растворов спиродиклофен-енола.

Градуировочные растворы с концентрациями спиродиклофен-енола 0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 и 0,25 мкг/см³ соответственно готовят методом последовательного разбавления по объему, используя подвижную фазу.

8.5.4.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора спиродиклофен-енола и доводят до метки подвижной фазой.

8.5.4.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,25 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ вносят 2,5 см³ раствора N 1 и доводят до метки подвижной фазой.

8.5.4.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

8.5.4.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

8.5.4.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,025 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

8.5.4.6. Раствор N 6 с концентрацией 0,0125 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора N 5 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основные растворы спиродиклофена и спиродиклофен-енола можно хранить в холодильнике при температуре плюс 0 - 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения спиродиклофена и спиродиклофен-енола используют ацетонитрильные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

8.6. Построение градуировочного графика.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация метамифопа в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации спиродиклофена или спиродиклофен-енола в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику следует проверять перед началом измерений.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации спиродиклофена или спиродиклофен-енола в градуировочном растворе,

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации спиродиклофена или спиродиклофен-енола в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

9.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <2>.

--------------------------------

<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79; ГОСТ Р 59024 "Национальный стандарт Российской Федерации. Вода. Общие требования к отбору проб", утвержден и введен в действие Приказом Росстандарта от 10.09.2020 N 640-ст; ГОСТ Р 58595 "Национальный стандарт Российской Федерации. Почвы. Отбор проб", утвержден и введен в действие Приказом Росстандарта от 10.10.2019 N 954-ст; ГОСТ 10852 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", утвержден и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 18.12.1986 N 3979; ГОСТ 31760 "Масло соевое. Технические условия", введен в действие Приказом Росстандарта от 29.11.2012 N 1630-ст; ГОСТ 27572 "Межгосударственный стандарт. Яблоки свежие для промышленной переработки. Технические условия", введен в действие Приказом Росстандарта от 24.11.2017 N 1830-ст; ГОСТ 32786-2014 "Виноград столовый свежий. Технические условия", введен в действие Приказом Росстандарта от 30.10.2014 N 1472-ст.

Пробы яблок и яблочного сока, винограда и виноградного сока хранят до анализа в герметичной таре в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C, сок хранят в холодильнике при температуре плюс 0 - 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы доводят до стандартной влажности и измельчают.

Зеленую массу хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре минус 18 °C до анализа. Пробы масла хранят в холодильнике при плюс 0 - 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре не более 2-х месяцев.

10.1. Определение спиродиклофена в воде.

Пробу воды 50 см³ помещают в делительную воронку вместимостью 500 см³, добавляют 20 см³ гексана и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз, верхний органический слой собирают, к водному добавляют 20 см³ гексана и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия и собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.4.

10.2. Определение спиродиклофена и спиродиклофен-енола в почве, спиродиклофена в зеленой массе, бобах и масле сои, плодах и соке яблок, ягодах и соке винограда.

Навеску измельченной матрицы или сока (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, последовательно добавляют 10 см³ ацетонитрила, 5 см³ воды (для почвы, бобов и масла), 4 г безводного сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 1 г лимоннокислого натрия трехзамещенного 2-водного и 0,5 г лимоннокислого натрия двузамещенного 1,5-водного. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 5 см³, переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, содержащую 150 мг сорбента для твердофазной экстракции на основе первичного-вторичного амина (PSA) и 900 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4000 об./мин. От верхнего слоя отбирают 0,5 см³, добавляют 0,5 см³ 0,005 М H₃PO₄ и 10 мм³ вводят в хроматограф. Для проб зеленой массы, бобов и масла от верхнего слоя отбирают 0,5 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше плюс 40 °C. Сухой остаток чистят на патроне по п. 10.3.

10.3. Очистка на патроне для твердофазной экстракции.

Сухой остаток, полученный по п. 9.2, растворяют в 1 см³ гексана, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.3), колбу ополаскивают 1 см³ гексана и также наносят на патрон. Патрон промывают 5 см³ гексана, элюат отбрасывают. Спиродиклофен элюируют 5 см³ смеси N 1, элюат собирают, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не более плюс 40 °C, остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

10.4. Условия хроматографирования:

- ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстро-сканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки;

- аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18 (50 x 2,1) мм, 1,7 мкм;

- температура колонки плюс 30 +/- 1 °C;

- подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 65:35 (для спиродиклофена) и 45:55 (для спиродиклофен-енола);

- скорость потока элюента 0,2 см³/мин;

- рабочая длина волны УФ-детектора 216 нм;

- объем вводимой пробы 10 мм³.

11.1. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание спиродиклофена или спиродиклофен-енола в пробе X (мг/кг, мг/дм³) вычисляют по формуле:

где A - концентрация вещества, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографического пика, мкг/см³;

f - полнота извлечения спиродиклофена или спиродиклофен-енола, приведенная в табл. 3 - 4, %;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³ (1 см³);

P - навеска анализируемого образца, г, см³ (аликвота, равная 0,5 г, вода 50 см³).

Содержание остаточных количеств спиродиклофена или спиродиклофен-енола в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений. Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор спиродиклофена или спиродиклофен-енола с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг (мг/дм³);

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг (мг/дм³);

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения".

Например: менее 0,05 мг/кг*, где * - 0,05 мг/кг - предел определения спиродиклофена в почве.

14.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

14.2. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

14.3. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг (мг/дм³); при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг (мг/дм³):

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 12.1) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении этого условия процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

14.4. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.