"МУК 4.1.3660-20. 4.1. Методы контроля химических факторов. Определение остаточных количеств бензовиндифлупира в горохе и семенах подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 27.10.2020)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, Л.Г. Бондарева).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 27 октября 2020 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения в горохе и семенах подсолнечника концентрации бензовиндифлупира в диапазоне 0,01 - 0,20 мг/кг.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими исследования в области безопасности и качества пищевой продукции и продовольственного сырья.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Характеристика вещества и основные физико-химические свойства представлены в табл. 2.1.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности p = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1, для соответствующих диапазонов концентраций (согласно ГОСТ Р ИСО 5725).

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 3.2.

4.1 Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором.

4.2. Экстракцию бензовиндифлупира из анализируемых проб гороха и семян подсолнечника выполняют смесью ацетонитрила и воды с добавлением 1 см³ ледяной уксусной кислоты, центрифугированием, очисткой экстракта на картридже, заполненным сорбционным материалом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола.

4.3. Нижний предел измерения бензовиндифлупира в анализируемом объеме пробы - 1 нг. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание: допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки.

Примечание: допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовые хроматографы.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Очистка растворителей.

8.1.1. Ацетонитрил. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.

8.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 650 см³ ацетонитрила и 350 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 30 дней.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 8.2) при скорости подачи растворителя 1,0 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.4. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.4.1. Исходный раствор бензовиндифлупира для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0100 +/- 0,0005 г бензовиндифлупира, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится в холодильнике (+2 - 6 °C) не более 9 месяцев.

Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

8.4.2. Раствор N 1 бензовиндифлупира для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора бензовиндифлупира (п. 8.4.1) с концентрацией 100 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор N 1 хранится в холодильнике (+2 - 6 °C) не более 6 месяцев.

8.4.3. Рабочие растворы N 2 - 6 бензовиндифлупира для градуировки (концентрация 0,05 - 1,0 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 и 10,0 см³ рабочего раствора N 1 с концентрацией 10,0 мкг/см³ (п. 8.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрациями бензовиндифлупира 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1,0 мкг/см³.

Растворы хранят в холодильнике при температуре +2 - 6 °C не более трех месяцев.

8.5. Приготовление смесей органических растворителей для экстракции.

8.5.1. Смесь ацетонитрил-вода = 8:2 (по объему).

В мерную колбу на 500 см³ вносят 400 см³ ацетонитрила и 100 см³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

8.5.2. Смесь ацетонитрил-вода = 2:8 (по объему).

В мерную колбу на 500 см³ вносят 100 см³ ацетонитрила и 400 см³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

8.6. Подготовка картриджа для очистки и концентрирования экстракта.

Картридж устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума. Промывают картридж последовательно 1 см³ метанолом, 1 см³ ацетонитрилом, затем три раза по 1 см³ смесью ацетонитрил-вода, в соотношении 2:8 по объему, приготовленной по п. 8.5.2. Процедуру проводят с использованием вакуума. Скорость элюирования 15 - 20 капель в минуту. Не допускать высыхания верхнего слоя сорбента в картридже.

Не допускать высыхания верхнего слоя сорбента в картридже.

8.7. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации бензовиндифлупира в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных ниже. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков бензовиндифлупира, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух градуировочных растворов, содержание бензовиндифлупира в которых должно входить в диапазон линейности градуировочной характеристики от 0,05 до 1 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация бензовиндифлупира в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора бензовиндифлупира, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

9.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <2>.

--------------------------------

<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов от 21.08.1979 N 2051; "Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности". Москва, 2018. 64 с.

Пробы зерна гороха хранят в холодильнике при температуре +2 - 6 °C не более 4 дней. Пробы семян подсолнечника подсушивают и хранят при комнатной температуре не более 2 недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.

10.1. Подготовка образцов к измерению.

Образец измельченных зерен гороха или семян подсолнечника массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 см³. Добавляют 100 см³ смеси растворителей ацетонитрила и воды в соотношении 8:2, приготовленной в соответствии с п. 8.5.1. Перемешивают. Оставляют в покое на 15 минут. После чего добавляют 1 см³ ледяной уксусной кислоты и помещают на встряхиватель на 30 минут. Раствор декантируют и фильтруют через неплотный бумажный фильтр. Осадок в колбе заливают 30 см³ смеси ацетонитрил-вода (8:2), приготовленной согласно п. 8.5.1. Экстрагируют в течение 15 минут на встряхивателе. После отстаивания раствор фильтруют через неплотный бумажный фильтр. Фильтраты объединяются и переносятся в круглодонную колбу объемом 250 см³. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C до водного остатка (15 - 20 см³). Водный остаток пропускают через подготовленный в соответствии с п. 8.6 картридж со скоростью 15 - 20 капель в минуту, используя разряжение, создаваемое водоструйным насосом. После пропускания пробы картридж четыре раза по 1 см³ промывают смесью ацетонитрил-вода в соотношении 2:8, приготовленной в соответствии с п. 8.5.2. Бензовиндифлупир элюируют с картриджа ацетонитрилом 2 раза по 1 см³. Элюат собирают в круглодонную колбу объемом 50 см³. Упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 30 °C до влажного остатка. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 8:2, приготовленной в соответствии с п. 8.5.1. Перед хроматографированием пробу дополнительно фильтруют через мембранный фильтр.

10.2. Условия хроматографирования.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором и термостатом колонки;

- хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми алкильными группами (C-18 или C-8) для удерживания гидрофильных соединений, зернением 5 мкм;

- рабочая длина волны 254 нм;

- температура колонки 25 °C;

- подвижная фаза ацетонитрил-бидистиллированная вода (65:35, по объему);

- скорость потока элюента 1,0 см³/мин;

- объем вводимой пробы 20 мм³;

- линейный диапазон детектирования 1 - 20 нг.

11.1. Содержание бензовиндифлупира в пробах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

C - концентрация бензовиндифлупира, найденная по градуировочному графику в соответствии с площадью хроматографического пика, мкг/см³;

f - полнота извлечения.

Примечание. Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг, мг/дм³;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг.

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание бензовиндифлупира в пробе (горох, семена подсолнечника) - менее 0,01 мг/кг" <3>.

--------------------------------

<3> 0,01 мг/кг - предел обнаружения бензовиндифлупира в горохе, семенах подсолнечника.

13.1. Организация контроля качества результатов определения осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , - среднее арифметическое результатов параллельных определений содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости R:

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

1. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

2. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания"

3. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений".

4. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

5. ГОСТ 20490 "Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия".

6. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

7. ГОСТ 4221 "Реактивы. Калий углекислый. Технические условия".

8. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

9. ГОСТ 9737 "Посуда лабораторная стеклянная. Шлифы сферические взаимозаменяемые".

10. ГОСТ 21241 "Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний".

11. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

12. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

13. ГОСТ 12.1.018 "Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования".

14. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

15. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

16. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

17. ГОСТ 27570.46 "Безопасность бытовых и аналогичных электрических приборов. Дополнительные требования к измельчителям пищевых отходов и методы испытаний".

18. ГОСТ 26678 "Холодильники и морозильники бытовые электрические".

19. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов N 2051-79 от 21.08.79.

20. Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности. Москва, 2018. 64 с.