"МУК 4.2.3567-19. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.10.2019)

1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 24 октября 2019 г.

3. Введены впервые.

1.1 Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2 МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль микробиологического загрязнения воздушной среды, а также санитарных лабораторий биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий, научно-исследовательских организаций, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на проведение микробиологических исследований.

1.3 МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Штамм Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394, включающий рекомбинантный фрагмент ДНК, предполагается использовать в промышленном производстве фермента ксиланазы для кормовых целей.

Мезофил. Хороший рост штамма наблюдается через 24 часа при 25 - 28 °C на глюкозо-пептонном агаре (ГПА).

Штамм растет также на агаризованных средах - глюкозо-пептон-дрожжевом агаре (YPD), глицерин-пептон-дрожжевом агаре (YPG), мясопептонном агаре (МПА), АГВ среде, картофельный агаре (КА).

При росте на агаризованной среде образуются гладкие, округлые колонии с матовой поверхностью светло-бежевого цвета, край ровный. При росте в жидкой среде клетки образуют ровную интенсивную муть, пристеночных пленок не образуют, наблюдается белый осадок, коагуляция отсутствует.

На среде YPD штамм образует клетки округлой, слегка овальной формы размером 3 - 4 мкм, клетки почкуются, почкование многостороннее, истинного мицелия не образуют.

Штамм Komagataella (Pichia) pastoris депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером БРЦ ВКПМ Y-4394.

Штамм Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенных в санитарных правилах <1>. Работа со штаммом Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 не требует специальных мер предосторожности.

--------------------------------

<1> СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

Предельно допустимая концентрация (ПДК) Komagataella (Pichia) pastoris в воздухе рабочей зоны установлена в гигиенических нормативах <2>.

--------------------------------

<2> ГН 2.2.6.3538-18 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в воздухе рабочей зоны".

3.1. Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4.1. Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток псевдомицелия и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы, указанные в табл. 1.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6.1. Измерение концентрации клеток гриба в воздухе рабочей зоны осуществляется в соответствии с санитарными правилами <3>. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019 и инструкции по эксплуатации прибора.

--------------------------------

<3> СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

6.2. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним профессиональным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8.1. Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление 760 +/- 20 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80%.

9.1. Для приготовления глюкозо-пептон-дрожжевого агара используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1 000 см³): пептон - 10,0 г, глюкоза - 10,0 г, дрожжевой экстракт - 10,0 г, агар-агар - 15,0 г, дистиллированная вода - 1 000 см³.

Сухие компоненты растворяют в 1 000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C не более 10 дней.

10.1. Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005 и ГОСТ Р 8.563.

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с Инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (YPD) расплавляют, остужают до 50 - 60 °C и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методическими указаниями <4>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °C не более 10 дней.

--------------------------------

<4> Пункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28 +/- 2) °C. Через 1 - 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии методическими указаниями <5>. Для этого эталонный музейный штамм Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

--------------------------------

<5> МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

11.1. Расчет концентрации клеток производят по формуле:

К - концентрация штамма в воздухе, кл/м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

T - время аспирации, мин.

12.1. По окончании измерения и расчета концентрации клеток микроорганизма в воздухе должен быть составлен протокол (отчет), в котором представлена необходимая информация:

- о месте отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы)

- о марке пробоотборника, который использовался исследователями, питательной среде и времени инкубации

- о лицах, производивших отбор проб воздуха, идентификацию штамма и расчет концентрации штамма.

Основные качественные и количественные параметры измерения представляются в виде табл. 4.