"МУК 4.1.3283-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флудиоксонила в капусте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 08.07.2015)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова, Ж.А. Чистова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 8 июля 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации N РОСС RU.0001.310430/0220.11.14.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентраций флудиоксонила в капусте в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

4-(2,2-Дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)пиррол-3-карбонитрил (IUPAC).

Эмпирическая формула: C₁₂H₆F₂N₂O₂.

Молекулярная масса: 248,2.

Кристаллическое вещество желтоватого цвета без запаха. Температура плавления: 199,8 °C. Давление паров при 25 °C: 3,9 x 10^-4 мПа. Растворимость в органических растворителях (в г/дм³ при 25 °C): ацетон - 190; этанол - 44, толуол - 2,7; н-октанол - 20; гексан - 0,0078. Растворимость в воде: 1,8 мг/дм³ (25 °C). Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow logP = 4,12 (25 °C). Гидролитически стабилен до 70 °C в диапазоне pH 5 - 9.

Флудиоксонил - контактный фунгицид широкого спектра действия с продолжительной активностью.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении флудиоксонила с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым и/или флуоресцентным детекторами после извлечения вещества из анализируемых образцов смесью ацетонитрил-вода (8 : 2, по объему), очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на жидкостном хроматографе, и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик, приготовление смесей растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения флудиоксонила на ней.

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

7.1.4.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.4.2. Очистка растворителей. Растворитель промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, вносят 500 см³ бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

Колонку промывают подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 0,8 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. Исходный раствор флудиоксонила для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,010 г флудиоксонила, растворяют в 50 - 70 см³ ацетонитрила, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 3 месяцев.

Градуировочные растворы N 2 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2. Раствор N 1 флудиоксонила для градуировки и внесения (концентрация 5 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 5,0 см³ исходного раствора флудиоксонила с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике при 4 - 6 °C в течение 3 месяцев.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено - найдено" и контроле точности методом добавок.

7.4.3. Рабочие растворы N 2 - 5 флудиоксонила для градуировки (концентрация 0,05 - 0,5 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 50 см³ помещают по 0,5; 1,0, 2,5 и 5 см³ раствора N 1 флудиоксонила с концентрацией 5 мкг/см³ (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией флудиоксонила 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике при 4 - 6 °C в течение месяца.

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площадей пиков (мЕА·с или ЕЛ·с) от концентрации флудиоксонила в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 80 см³ гексана и 20 см³ этилацетата, перемешивают. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 30 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают смесью гексан-этилацетат в объемном соотношении 8 : 2, порцией 20 см³, скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/см³, упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 3 см³ смеси гексан-этилацетат (8 : 2, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 40 - 60 с, и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей, порциями по 3 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 40 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8 : 2, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 60 см³ смеси гексан-этилацетат (8 : 2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ, анализируют содержание флудиоксонила по п. 9.4.

Фракции, содержащие флудиоксонил, объединяют и вновь анализируют.

Примечание. Проверку хроматографического поведения флудиоксонила следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 400 см³ ацетонитрила и 100 см³ воды, перемешивают. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 80 см³ гексана и 20 см³ трет-бутилметилового эфира, перемешивают. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ 1724-85 "Капуста белокочанная свежая, заготовляемая и поставляемая. Технические условия", ГОСТ Р 51809-2001 "Капуста белокочанная свежая, реализуемая в розничной торговой сети. Технические условия", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979).

Отобранные пробы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре ниже -18 °C.

Перед анализом образцы измельчают.

Измельченный образец массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см³, вносят 100 см³ смеси ацетонитрил-вода (8 : 2, по объему) и помещают на встряхиватель на 1 час.

Пробе дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр средней плотности. Осадок на фильтре промывают 30 см³ смеси ацетонитрил-вода (8 : 2, по объему). Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/2 его часть (эквивалентную 10 г образца) переносят в делительную воронку на 100 - 250 см³ и очищают в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2, затем на колонке с силикагелем по п. 9.3.

К аликвоте экстракта пробы (1/2 часть), находящейся в делительной воронке, добавляют 20 см³ гексана, интенсивно встряхивают 1 мин. Верхний гексановый слой отбрасывают. Нижнюю ацетонитрильную фазу переносят в колбу для упаривания на 250 см³ и упаривают до водного остатка (5 - 10 см³) при температуре 35 - 40 °C.

Водный остаток в колбе переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 70 см³ бидистиллированной воды, 20 см³ насыщенного хлористого натрия и 20 см³ смеси гексан-трет-бутилметиловый эфир (4 : 1, по объему), предварительно обмыв ими колбу, в которой находилась проба, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, после полного разделения фаз верхний слой собирают, нижний водный слой возвращают в воронку и экстракцию повторяют новой порцией смеси гексан-метил-третбутиловый эфир объемом 20 см³. Нижний водный слой отбрасывают.

Объединенный экстракт фильтруют через слой (около 2 см) безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в химическую воронку, в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 см³, упаривают досуха. Остаток растворяют в 3 см³ смеси гексан-этилацетат (8 : 2, по объему) и очищают на колонке с силикагелем по п. 9.3.

Растворенный в 3 см³ смеси гексан-этилацетат (8 : 2, по объему) остаток, полученный по п. 9.2, наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды смесью гексан-этилацетат (8 : 2, по объему) порциями по 3 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 40 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8 : 2, элюат отбрасывают.

Флудиоксонил элюируют с колонки 50 см³ этой же смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8 : 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 см³, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C, остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы и анализируют содержание флудиоксонила по п. 9.4.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым и/или флуоресцентным детекторами, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником, термостатом колонки и системой градиентного элюирования <*>

--------------------------------

<*> Идентификация с применением 2 альтернативных детекторов повышает надежность определения.

Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, зернением 5 мкм

Температура колонки: 25 °C

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (50 : 50, по объему)

Скорость потока элюента: 0,8 см³/мин

Объем вводимой пробы: 50 мм³

Линейный диапазон детектирования 2,5 - 25 нг

Рабочая длина волн: 268 нм

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков вещества (в мЕА·с или ЕЛ·с), находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию флудиоксонила в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, не более чем в 50 раз.

Содержание флудиоксонила в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

C - концентрация флудиоксонила, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

К - коэффициент, учитывающий объем аликвоты экстракта, используемый для анализа (равен 2).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание флудиоксонила в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>

--------------------------------

<*> - 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание флудиоксонила в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 0,5 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого градуировочного раствора, используемого для контроля, сохраняется соотношение:

X - концентрация флудиоксонила в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора флудиоксонила, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флудиоксонила, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.5.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг.

Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения с последующим уточнением по мере накопления информации,

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если выполняется условие (4), то воспроизводимость измерений считается удовлетворительной.

При превышении норматива контроля воспроизводимости эксперимент повторяют, при повторном превышении указанного норматива выясняют причины и по возможности их устраняют.