"МУК 4.2.3526-18. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 01.02.2018)

1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Минздрава России (Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 февраля 2018 г.

4. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

Штамм Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 выделен с поверхности листьев сои в Новосибирской области в 2010 г.

На основе штамма энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 создан инсектицид "Биослип БТ, П", который обладает широким спектром действия в отношении насекомых - вредителей сельского хозяйства, относящихся к отрядам Чешуекрылые и Двукрылые. Он активен в отношении личинок бабочек из семейства Белянки, Совки, Настоящие моли, Выемчатокрылые моли, Огневки, Плодожорки, а также в отношении насекомых из отряда Двукрылые: журчалок, галлиц, серебрянок.

Действующей основой препарата являются кристаллы белкового и жизнеспособные споры штамма B. thuringiensis ssp. toumanoffi 25. Содержание жизнеспособных спор в инсектициде "Биослип БТ, П" составляет не менее 1 x 10¹⁰ КОЕ/г, количество кристаллов токсина равно общему количеству спор в препарате. В качестве вспомогательных веществ инсектицид содержит остатки защитной среды для сублимационной сушки - неорганические фосфаты, сухое молоко, желатин. Инсектицид представляет собой водорастворимый порошок.

Кристаллы токсина действуют в кишечнике насекомого при поедании, белковый токсин растворяется в кишечном соке насекомого при pH 9,5 - 10,5 и переходит в активную форму под действием протеолитических ферментов кишечного сока. В активном состоянии токсины формируют поры в клетках эпителия кишечника, что в дальнейшем приводит к гибели насекомого.

После попадания в кишечник насекомого гибель наступает в промежутке от 6 до 48 часов, в зависимости от вида насекомого, стадии его развития, количества попавшего в кишечник .

Белковый конденсируется в кристаллы ромбовидной формы (параспоральные тельца) и экскретируется на завершающей стадии спорообразования. Кристаллический обладает высокой термостабильностью.

Штамм B. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 представляет собой грамположительные, подвижные, образующие жгутики палочки размером 0,7 - 1,2 x 2,5 - 4,0 мкм. Через 48 часов роста на МПА образуют овальные споры размером 0,6 - 0,8 x 1,2 - 2,0 мкм. Одновременно со спорой образуются параспоральные тельца ромбовидной формы разных размеров. На среде АГВ и картофельно-глюкозном агаре образуют серые полупрозрачные колонии с ровным краем. Оптимальная температура роста +28 - 31 °C.

Штамм образует ацетилметилкарбинол, на желтковой среде лецито-вителлиновая реакция положительная, образует кислоту из маннозы, не образует кислоту при росте на салицине и сахарозе, не гидролизует эскулин, образует уреазу на среде с мочевиной, гидролизует крахмал, пептонизирует молоко, ДНКазная активность отсутствует, ингибирует рост Micrococcus lysodeikticus.

Штамм Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 по критериям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации относится к непатогенным для теплокровных животных микроорганизмов. Он не является фитопатогенным, а также не входит в состав 4 групп патогенности в соответствии с СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами" в редакции Дополнений и изменений N 2, утвержденных Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.06.2011 N 86.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50 000 кл./м³.

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Прямой метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны бактерий на мясо-пептонный агар (МПА) и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

При выполнении измерений концентрации штамма в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

6.2. СП 1.3.2518-09 Дополнения и изменения N 1 к СП 1.3.2322-08.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.4. Требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

Для приготовления мясо-пептонного агара (МПА) к 1 000 см³ мясо-пептонного бульона (МПБ) добавляют 15,0 г агар-агара, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.

Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C в течение 14 дней, не более.

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением N 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и ГОСТ 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

При выполнении анализа воздуха МПА расплавляют, остужают до 50 - 60 °C и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °C не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (30 +/- 2) °C. Через 1 - 2 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

где К - концентрация Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в воздухе, кл./м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

C - скорость аспирации воздуха, л/мин;

T - время аспирации, мин.

Результаты измерений оформляют протоколом по ниже приведенной форме.