"МУК 4.1.3284-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флубендиамида в воде и почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 08.07.2015)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова, Ж.А. Чистова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 8 июля 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации N РОСС RU.001.310430/0202.14.07.14.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флубендиамида в воде и почве в диапазоне 0,0005 - 0,005 мг/дм³, 0,04 - 0,4 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

N²-[1,1-диметил-2-(метилсульфонил)этил]-3-иодо-N¹-[2-метил-4-(1,2,2,2-тетрафтор-1-трифторметил)фенил] фталамид.

Эмпирическая формула: C₂₃H₂₂F₇N₂O₄.

Молекулярная масса: 682,4.

Белое кристаллическое вещество без характерного запаха. Температура плавления 217,5 - 220,7 °C. Плотность 1,659. Давление паров - менее 1·10^-4 Па (20 °C). Растворимость в органических растворителях (при 20 °C, в г/дм³): ацетон - 102, дихлорметан - 8,12, метанол - 26, н-гептан - 0,000835, п-ксилол - 0,488, этилацетат - 29,4. Растворимость в воде при 20 °C и pH 5,98 - 0,03 мг/дм³. Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода K_ow logP = 4,20. Слабо подвержен гидролизу в диапазоне pH 4 - 9.

Флубендиамид - инсектицид, принадлежащий к химическому классу бензолдикарбоксамидов (диамидов фталевой кислоты), рекомендуется для борьбы с широким спектром насекомых на различных сельскохозяйственных культурах (фрукты, овощи, виноград и др.).

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Диапазон полноты извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении флубендиамида с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после извлечения вещества из анализируемых образцов почвы подкисленной смесью ацетонитрил - вода (1:1, по объему), очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем. Для концентрирования и очистки проб воды используют патроны для твердофазной экстракции на основе октадецилсилана.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на жидкостном хроматографе, и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения флубендиамида на ней.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.3.2. Очистка растворителя. Растворитель промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ этилацетата и 500 см³ циклогексана, перемешивают. Смесь хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, добавляют 500 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, вносят 0,1 см³ ледяной уксусной кислоты, перемешивают. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 600 см³ ацетонитрила, добавляют 400 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, вносят 0,1 см³ ледяной уксусной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Колонку промывают подвижной фазой (приготовленной по п. 7.4.) при скорости подачи растворителя 0,8 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.6.1. Исходный раствор флубендиамида для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0100 г флубендиамида, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике (4 - 6 °C) в течение 3 месяцев.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.6.2. Раствор N 1 для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора флубендиамида с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.6.1), разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

Раствор с концентрацией 10 мкг/см³ используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения веществ методом "внесено - найдено", а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.6.3. Рабочие растворы N 2 - 5 для градуировки (концентрация 0,1 - 1,0 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.6.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией флубендиамида 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике (4 - 6 °C) в течение 3 месяцев.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации флубендиамида в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 50 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

7.8.1. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 80 см³ гексана и 20 см³ этилацетата, перемешивают.

7.8.2. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 7:3). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 70 см³ гексана и 30 см³ этилацетата, перемешивают.

7.8.3. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 6:4). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 60 см³ гексана и 40 см³ этилацетата, перемешивают.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 30 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают смесью гексан - этилацетат в объемном соотношении 8:2, порцией 20 см³, скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

--------------------------------

<*> Примечание. Проверку хроматографического поведения флубендиамида следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 флубендиамида с концентрацией 10 мкг/см³, упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Остаток растворяют 1 см³ этилацетата, вносят 4 см³ гексана, помещают на ультразвуковую баню на 30 с. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.9. Колбу обмывают дважды смесью гексан - этилацетат (8:2, по объему) порциями по 3 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 25 см³ смеси гексан - этилацетат в объемном соотношении 8:2, затем 50 см³ смеси гексан - этилацетат (7:3), элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 70 см³ смеси гексан - этилацетат (6:4, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ, анализируют содержание флубендиамида по п. 9.3.

Фракции, содержащие флубендиамид, объединяют и вновь анализируют.

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума и промывают последовательно 5 см³ ацетонитрила, затем 10 см³ бидистиллированной воды. Скорость потока растворителей через патрон не должна превышать 2 см³/мин, при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона. Патрон готовят непосредственно перед использованием.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 17.4.3.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб".

Пробы воды хранят в стеклянной или полиэтиленовой герметично закрытой таре в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более 10 суток.

Пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года.

Для длительного хранения пробы воды и почвы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °C до 2 лет.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

Образец отфильтрованной воды объемом 200 см³ подкисляют 0,02 см³ ледяной уксусной кислоты (0,01% по объему), перемешивают и вносят на концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.11, со скоростью пропускания раствора 2 - 3 капли в секунду, используя разряжение, создаваемое водоструйным насосом. Элюат отбрасывают. Высушивают патрон пропусканием воздуха (с использованием вакуума) в течение 5 мин. Вещество элюируют с патрона 3 см³ ацетонитрила, собирая элюат в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 50 см³. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха, остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы, приготовленной по п. 7.4, и анализируют содержание флубендиамида по п. 9.3.

Образец почвы массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см³, добавляют 80 см³ смеси ацетонитрил - вода (1:1), содержащей 0,01% ледяной уксусной кислоты (приготовленной по п. 7.3), колбы интенсивно встряхивают (вручную) и помещают на 2 мин в микроволновую печь при мощности 180 Вт.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр средней плотности. Остаток на фильтре промывают 20 см³ смеси ацетонитрил - вода (1:1), содержащей 0,01% ледяной уксусной кислоты. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр на 100 см³, перемешивают, измеряют объем, 1/2 часть экстракта (эквивалентную 10 г пробы) переносят в колбу для упаривания на 150 см³, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C до водного остатка (объем около 25 см³). Очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2.2, затем на колонке с силикагелем по п. 9.2.3.

Водный остаток в колбе, полученный по п. 9.2.1, находящийся в колбе для упаривания, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 20 см³ деионизованной воды, предварительно обмыв ею колбу, в которой находилась проба, 5 см³ насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают.

В делительную воронку вносят 50 см³ смеси этилацетат - циклогексан (1:1, по объему), приготовленной по п. 7.2, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия толщиной 1,5 см, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке. Процедуру экстракции водной фазы повторяют 30 см³ смеси этилацетат - циклогексан (1:1, по объему).

Объединенный органический экстракт, пропущенный через безводный сульфат натрия, упаривают при температуре 35 °C на ротационном вакуумном испарителе досуха и дополнительно очищают на колонке с силикагелем по п. 9.2.3.

Остаток, полученный по п. 9.2.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 1 см³ этилацетата, вносят 4 см³ гексана, помещают на ультразвуковую баню на 30 с. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.9. Колбу обмывают дважды смесью гексан - этилацетат (8:2, по объему) порциями по 3 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку смесью гексан - этилацетат последовательно в объемных соотношениях: 8:2 - порцией 25 см³, затем 7:3 - порцией 50 см³ и 6:4 - порцией 10 см³, элюат отбрасывают.

Флубендиамид элюируют с колонки 50 см³ <*> смеси гексан - этилацетат в объемном соотношении 6:4 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 см³, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C.

--------------------------------

<*> Примечание. Объем элюента может быть изменен в соответствии с результатами проверки хроматографического поведения вещества на колонке по п. 7.10.

Остаток растворяют в 4 см³ подвижной фазы, приготовленной по п. 7.4, и анализируют содержание флубендиамида по п. 9.3.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником, термостатом колонки и системой градиентного элюирования

Рабочие длины волн: 254 и 236 нм <*>

--------------------------------

<*> Примечание. Для достоверности идентификации флубендиамида его детектирование возможно при длине волны 236 нм, поскольку в данной области интенсивность поглощения вещества ~ в 1,5 раза выше, чем при 254 нм. Соблюдение соотношения площадей пиков при этих волнах подтверждает наличие остаточных количеств действующего вещества в пробе.

Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 5 мкм

Температура колонки: 30 °C

Скорость потока элюента: 0,8 см³/мин

Объем вводимой пробы: 50 мм³

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (60:40, по объему) с внесением 0,1 см³ ледяной уксусной кислоты

Линейный диапазон детектирования 5 - 50 нг

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4 (не более чем в 50 раз).

Содержание флубендиамида в пробах (X, мг/дм³, мг/кг) рассчитывают по формуле:

A - концентрации флубендиамида, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса (объем) анализируемого образца, г, см³;

C - коэффициент, учитывающий объема экстракта, взятого для анализа, C = 1 (вода), C = 2 (почва).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг, мг/дм³,

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг, мг/дм³;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг, мг/дм³;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание флубендиамида в пробах воды - менее 0,0005 мг/дм³, почвы - менее 0,04 мг/кг". <*>

--------------------------------

<*> - 0,0005 мг/дм³ и 0,04 мг/кг - пределы обнаружения соответственно.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание флубендиамида в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого градуировочного раствора, используемого для контроля, сохраняется соотношение:

X - концентрация флубендиамида в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора флубендиамида, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флубендиамида, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.7.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, мг/дм³.

Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения с последующим уточнением по мере накопления информации,

- граница абсолютной погрешности, мг/кг, мг/дм³;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг, мг/дм³.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R)

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг, мг/дм³;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.