"МУК 4.1.3504-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флуксапироксада в цитрусовых, плодовых косточковых (нектарины, персики), клубнике, бананах, томатах, баклажанах, салате-латук, луке-порее, сое (бобы, масло), хлопке (семена, масло), рисе, кофе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в цитрусовых, плодовых косточковых (нектарины, персики), клубнике, бананах, томатах, баклажанах, салате-латук, луке-порее, сое (бобы, масло), хлопке (семена, масло), рисе, кофе массовой концентрации флуксапироксада в диапазонах 0,01 - 0,1 мг/кг (растения) и 0,008 - 0,08 мг/кг (масло).

Методические указания носят рекомендательный характер.

3-Дифторметил-1-метил-N-(3,4,5-трифтор[1,1-бифенил]-2-ил)-1H-пиразол-4-карбоксамид (ИЮПАК).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₈H₁₂F₅N₃O.

Молекулярная масса: 381,3.

Твердое порошкообразное вещество бежевого цвета без запаха. Температура плавления: 156,8 °C. Давление паров: 2,7 x 10^-7 МПа (при 25 °C). Растворимость в органических растворителях при 20 °C (в г/дм³): ацетон - 250; ацетонитрил > 100; дихлорметан > 100; метанол - 53,4; толуол - 20,0; этилацетат - 123,3. Растворимость в воде при 20 °C (в мг/дм³): 3,78. Флуксапироксад гидролитически стабилен при pH 4 - 9.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс > 2 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для кроликов > 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс > 5,1 мг/дм³.

Область применения. Флуксапироксад - системный фунгицид, относится к классу пиразолкарбоксамидов, рекомендуется для борьбы с комплексом болезней зерновых культур.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определение вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.

Уровни флуксапироксада в цитрусовых, плодовых косточковых, клубнике, бананах, томатах, баклажанах, салате-латук, луке-порее, сое (семена), хлопке (семена), рисе, кофе определяют после экстракции из анализируемых проб смесью метанол - вода, центрифугирования, очистки переэкстракцией в этилацетат. Флуксапироксад в растительном масле определяют после экстракции образца, растворенного в гексане, ацетонитрилом.

Нижний предел измерения флуксапироксада в анализируемом объеме пробы - 0,004 нг.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-15. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.1.2.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают. Раствор хранят в стеклянной посуде в течение 3 месяцев.

7.1.2.2. Очистка растворителя. Этилацетат промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. Растворитель хранят в стеклянной посуде в течение 1 месяца.

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ метанола, доводят до метки бидистиллированной водой, перемешивают.

Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 50 см³ бидистиллированной воды, осторожно приливают 16,6 см³ 37%-й соляной кислоты, доводят до метки водой, перемешивают.

Компонент А: в мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, вносят 1,0 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Компонент Б: в мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ деионизированной воды, вносят 1,0 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Каждый компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 7.4, в соотношении 1:1) при скорости подачи растворителя 0,4 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.6.1. Исходный раствор флуксапироксада для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г флуксапироксада, добавляют 50 - 70 см³ метанола, перемешивают, доводят метанолом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

Растворы N 1 - 8 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.6.2. Раствор N 1 флуксапироксада для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора флуксапироксада (п. 7.6.1) с концентрацией 100 мкг/см³, разбавляют метанолом до метки, перемешивают. Раствор N 1 хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

7.6.3. Раствор N 2 флуксапироксада для градуировки и внесения (концентрация 0,1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают по 1,0 см³ градуировочного растворов N 1 с концентрацией флуксапироксада 10,0 мкг/см³ (п. 7.6.2), доводят до метки метанолом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 2 с концентрацией флуксапироксада 0,1 мкг/см³. Раствор N 2 хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C) в течение одного месяца.

7.6.4. Рабочие растворы N 3 - 7 флуксапироксада для градуировки (концентрация 0,8 - 10 нг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 10,0; 5,0; 2,5; 1,0 и 0,8 см³ градуировочного раствора N 2 с концентрацией флуксапироксада 0,1 мкг/см³ (п. 7.6.3), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 3 - 7 с концентрацией флуксапироксада 10,0; 5,0; 2,5; 1,0 и 0,8 нг/см³ соответственно. Растворы хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение одной недели.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (I) от концентрации флуксапироксада в растворе (нг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Отбор проб осуществляют в соответствии с ГОСТ Р 53596-09 "Плоды цитрусовых культур для употребления в свежем виде. Технические условия"; ГОСТ Р 54702-11 "Персики и нектарины свежие. Технические условия"; ГОСТ Р 53884-10 "Земляника, реализуемая в розничной торговле. Технические условия", ГОСТ Р 50520-93 "Земляника. Руководство по хранению в холодильных камерах"; ГОСТ Р 51603-2000 "Бананы свежие. Технические условия"; ГОСТ 1725-85 "Томаты свежие. Технические условия"; ГОСТ 13907-86 "Баклажаны свежие. Технические условия"; ГОСТ Р 54703-11 "Салат-латук, эндивий кудрявый, эндивий эскариол свежие. Технические условия"; ГОСТ 31854-12 "Лук-порей свежий, реализуемый в розничной торговле"; ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках"; ГОСТ 16298-81 "Хлопок-сырец машинного сбора. Технические условия"; ГОСТ 6292-93 "Крупа рисовая. Технические условия"; ГОСТ ISO 4072-15 "Кофе зеленый в мешках. Отбор проб", а также в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Растительные пробы хранят при температуре (4 +/- 2) °C не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.

Перед анализом образцы измельчают.

Образец массой 5 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см³, добавляют 100 см³ смеси метанол - вода (подготовленной по п. 7.2), помещают на аппарат для встряхивания на 15 минут.

Пробам дают отстояться. Затем аликвоту экстракта объемом 10 см³ переносят в центрифужную пробирку с пробкой на 15 см³, центрифугируют 5 мин при 4 000 об./мин. Переносят 2 см³ супернатанта в центрифужную пробирку с пробкой на 50 см³, добавляют 200 мм³ 2 М соляной кислоты (подготовленной по п. 7.3), 8 см³ насыщенного раствора хлорида натрия и 10 см³ этилацетата, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, затем центрифугируют 2 мин при 4 000 об./мин.

Переносят 8 см³ верхней фазы в круглодонную колбу на 50 см³ и упаривают досуха при 40 °C. Остаток растворяют в 1 мл смеси метанол - вода (подготовленной по п. 7.2) при помощи ультразвуковой бани, фильтруют и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2.

Образец масла массой 5 г помещают в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 50 см³ гексана и 50 см³ ацетонитрила, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, затем сливают ацетонитрильную фазу (нижняя) в новую делительную воронку.

Промывают ацетонитрильную фазу 50 см³ гексана, сливают ацетонитрильную фазу (нижняя) в мерную колбу на 100 см³ и доводят до метки ацетонитрилом.

Переносят аликвоту 2 см³ в круглодонную колбу на 50 см³ и упаривают досуха при 40 °C. Остаток растворяют в 1 мл смеси метанол - вода (подготовленной по п. 7.2) при помощи ультразвуковой бани, фильтруют и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором (тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов).

Источник ионизации: электростатическое распыление.

Режим работы: регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация "перехода").

Материнский ион (масса/заряд): 382,1.

Дочерние ионы (масса/заряд): 362,2 (количественный расчет), 342,2

Напряжение на фрагментаторе, В: 119.

Энергия разрушения (соударения), В: 9 , 17 .

Скорость сканирования: 200 мс.

Давление на распылителе: 35 psi.

Скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм³/мин.

Температура газа 1: 250 °C.

Скорость газа 2 (азот): 11 дм³/мин.

Температура газа 2: 340 °C.

Температура квадруполей (1 и 3): 100 °C.

Хроматографическая колонка стальная длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм.

Температура колонки: 40 °C.

Скорость потока элюента: 0,4 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 5 мм³.

Подвижная фаза: 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле - 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в воде (50:50, изократический режим элюирования).

Линейный диапазон детектирования: 0,004 - 0,05 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 10,0 нг/см³, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

Содержание флуксапироксада в растительных пробах и пробах масла (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

A - концентрация флуксапироксада, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, нг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

C - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, C = 62,5 (растения), C = 50 (масло).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание флуксапироксада в растительных пробах - менее 0,01 мг/кг <*>; в пробах масла - менее 0,008 мг/кг <*>".

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг; 0,008 мг/кг - пределы обнаружения флуксапироксада в растительных пробах и пробах масла соответственно.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание флуксапироксада в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,8 до 10,0 нг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация флуксапироксада в пробе при контрольном измерении, нг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора флуксапироксада, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, нг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флуксапироксада, предусмотренных МИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.7.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.