"МУК 4.2.3248-14. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Микробиологическое измерение концентрации клеток микроорганизма Rhodococcus jialingiae 1kp ВКПМ Ac-1957 в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 30.12.2014)

1. Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. N 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

Сборник методических указаний "Измерение концентраций штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны" (выпуск 2) разработан с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций микроорганизмов их предельно допустимым концентрациям (ПДК), что является обязательным при осуществлении санитарно-эпидемиологического контроля.

Включенные в данный список методические указания по контролю биотехнологических штаммов в воздухе рабочей зоны разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССТБ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ 8.563-96 ГСИ. "Методики выполнения измерений".

Методики выполнены с использованием современных и адекватных микробиологических методов исследования и позволяют контролировать концентрации биотехнологических штаммов на уровне и ниже их ПДК в воздухе рабочей зоны, установленных в гигиенических нормативах.

Методические указания по измерению концентраций штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны предназначены для лабораторий центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, санитарно-микробиологических лабораторий промышленных предприятий, а также для научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований, для осуществления контроля за содержанием штаммов в воздухе рабочей зоны.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Rhodococcus jialingiae 1kp ВКПМ Ac-1957 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

Штамм бактерии выделен из нефтезагрязненных торфяных почв и верховых торфяников Тюменской области, природный изолят. Отобран по способности эффективно снижать содержание нефти в загрязненной ею воде, песке и почвах. Растет на средах с гексадеканом и нефтью в качестве единственных источников углерода.

Первоначально штамм был изолирован из ила очистных сооружений китайским микробиологом Цзя-Линг Ванг, в честь которого был и назван. Является компонентом биопрепарата по биоремедиации почв, грунтов, водоемов и стоков от нефти и нефтепродуктов.

По анализу секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, выделенный штамм является Rhodococcus jialingiae (99%). Аэроб. Способен к росту на средах, содержащих источники углерода. Хорошо утилизирует фруктозу, сорбит, маннит, инозит, слабее глюкозу, сахарозу, мальтозу, сукцинат, цитрат и бензоат, активно разлагает тирозин.

По систематическому положению относится к группе нокардиоформных актиномицетов к подгруппе бактерий, содержащих миколовые кислоты.

Макроскопически колонии микроорганизма круглые, непрозрачные, слизистые, блестящие, плоские, вершина приподнята, края ровные, окраска розовато-кремовая.

При микроскопическом исследовании культура представлена кокковидными клетками, встречаются палочки, неравномерными по толщине грамположительными клетками, споры отсутствуют. В молодой культуре палочки проявляют склонность к ветвлению (образование примитивного мицелия), диаметр клеток 0,6 - 0,8 мкм, длина в среднем составляет 4 - 8 мкм, в случае примитивного мицелия до 10 - 12 мкм. Цикл развития хорошо выражен, на ранних стадиях (20 - 24 ч) наблюдается элементарное ветвление, в дальнейшем (3 - 4 сут.) происходит распад длинных клеток на палочковидные и кокковидные элементы.

Мезофил. Рост очень хороший - через 24 ч при 25 - 28 °C образует колонии на глюкозо-пептонном агаре. Выдерживает концентрации хлорида натрия до 1% и немного более.

Штамм растет на жидких и агаризованных средах (ГПА, МПА, АГВ, картофельный агар). Можно культивировать на LB-агаре и в LB-бульоне или глюкозо-минеральной среде.

Штамм R. jialingiae 1kp депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Ac-1957.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50 000 кл./м³.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений бактерий на глюкозо-пептонный агар и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиологическим признакам.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

При выполнении измерений концентрации клеток в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

6.2. СП 1.3.2518-09. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

Для приготовления используют сухую готовую глюкозо-пептонную среду (ГПА): 50,0 г порошка размешивают в 1 000 см³ дистиллированной воды. Можно использовать отдельные компоненты среды следующего состава: пептон - 20,0 г, глюкоза - 10,0 г, хлорид натрия - 5,0 г, агар-агар - 15,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1 000 см³ дистиллированной воды и тщательно перемешивают.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.

Приготовление среды проводят аналогично п. 9.1, добавляя 10 г/л хлорида натрия, т.е. в 2 раза больше рекомендованного количества.

Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C в течение 14 дней, не более.

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением N 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и ГОСТ 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96°-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (ГПА) расплавляют, остужают до 50 - 60 °C и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее, чем на 18 ч. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °C не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (26 +/- 2) °C. Через 1 - 2 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам (прямой метод).

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Rhodococcus jialingiae 1kp ВКПМ Ac-1957 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

При выполнении анализа воздуха дополнительным (физиологическим) методом пробы воздуха отбирают на чашки Петри с ГПА, содержащей хлорид натрия в концентрации 1%. Дальнейшее выполнение анализа аналогично методу, приведенному выше.

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

К - концентрация микроорганизма в воздухе, кл/м;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.

Результаты измерений оформляют протоколом по ниже приведенной форме.