"МУК 4.1.3133-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств циазофамида в воде, почве, ботве и клубнях картофеля, плодах томатов и томатном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.11.2013)

1. Разработаны сотрудниками "ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии" (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, А.С. Комарова); ГБОУ ДПО "Российская медицинская академия последипломного образования" Минздрава России (М.С. Орлов).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Протокол от 29 октября 2013 г. N 3).

3. Утверждены врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 12 ноября 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.133/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации циазофамида в воде в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/дм3, в почве, клубнях картофеля, томатах и томатном соке - в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, в ботве картофеля - в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: циазофамид.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 4-хлор-2-циано-N,N-диметил-5-p-толилимидазол-1-сульфонамид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 324,78.

Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок белого цвета без запаха.

Температура плавления: 153 °C.

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода (20 °C).

Растворимость в воде (мг/дм3, 20 °C): 0,114.

Растворимость в органических растворителях (г/дм3, 20 °C): ацетон - 41,9; толуол - 5,3; гексан - 0,03; октанол - 0,25.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная - массы тела. Острая токсичность: рыбы , дафнии .

Область применения. Системный фунгицид, класса цианоимидазола, применяется против фитофтороза и других заболеваний, вызываемых грибами рода Оомицетов на картофеле, томатах, огурцах; обладает высокой эффективностью против фениламидустойчивых грибов.

В России для циазофамида гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении циазофамида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора (УФ) после его извлечения из образцов ацетонитрилом и последующей очистке на патроне для твердофазной экстракции (ТФЭ).

Идентификация циазофамида проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

Патроны для ТФЭ с гидрофильным слабокислотным сорбентом с постоянной активностью промывают 2 см3 смеси N 2, затем 3 см3 смеси N 1.

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты. (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5мг/см3: точную навеску циазофамида (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями циазофамида 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50).

7.4.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5,0 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение 2 дней.

При изучении полноты определения циазофамида в воде, почве, ботве и клубнях картофеля, томатах и томатном соке используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация циазофамида в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации циазофамида в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации циазофамида в градуировочном растворе;

- результат контрольного измерения массовой концентрации циазофамида в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора циазофамида с концентрацией 1 мкг/см3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см3 смеси N 1 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см3 смеси N 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 3 см3 смеси N 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют циазофамид смесью N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы (ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 50:50) и анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие циазофамид, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения циазофамида на патронах следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб". Отбор проб картофеля производится в соответствии с ГОСТ 7194-81 "Картофель свежий. Правила приемки и методы определения качества"; томатов - по ГОСТ 1725-85 "Томаты свежие".

Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы овощей хранят до анализа в герметичной упаковке в морозильной камере при -18 °C. Перед анализом пробы измельчают, не размораживая.

9.1. Экстракция циазофамида из воды

Пробу воды 100 см3 помещают в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 гексана и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз, верхний органический слой собирают, к водному добавляют 30 см3 гексана и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, и собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.2. Экстракция циазофамида из почвы, томатов, томатного сока, ботвы и клубней картофеля

Навеску измельченной культуры 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, последовательно добавляют 5 см3 воды (только для почвы), 10 см3 ацетонитрила, 8 г семиводного магния сернокислого и 1 г хлористого натрия. Пробирку плотно закрывают и помещают в аппарат для встряхивания на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают аликвоту 5 см3, переносят в круглодонную колбу вместимостью 25 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке по п. 9.3.

9.3. Очистка на патроне для ТФЭ

Сухой остаток, полученный по п. 9.2, растворяют в 1 см3 смеси N 1, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см3 смеси N 1 и также наносят на патрон. Патрон промывают 3 см3 смеси N 1, элюат отбрасывают. Циазофамид элюируют 4 см3 смеси N 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в подвижной фазе (1 см3 - почва, томаты, томатный сок, клубни картофеля; 5 см3 - ботва картофеля) и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.4. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка для неионогенных среднеполярных соединений (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 280 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание циазофамида в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

- площадь пика циазофамида на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P - навеска анализируемого образца, r;

f - полнота извлечения циазофамида, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств циазофамида в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие чем стандартный раствор циазофамида с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг*, где * - 0,01 мг/кг - предел обнаружения циазофамида в томатах).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

, - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг;

при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

X', X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

, - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.