"МУК 4.1.3407-16. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств клотианидина в яблоках, винограде, яблочном и виноградном соках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2016)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" (В.И. Долженко, А.С. Комарова, В.В. Человечкова) и ООО "Инновационный центр защиты растений" (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2016 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.230/01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации клотианидина в яблоках, винограде, яблочном и виноградном соках в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Клотианидин

(Е)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил-2-нитрогуанидин (IUPAC).

Молекулярная масса: 249,7.

Брутто формула: C₆H₈ClN₅O₂S.

Клотианидин представляет собой порошок без цвета и запаха. Температура плавления 176,8 °C. Давление пара - 1,3 x 10^-4 мПа (25 °C). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_ow lgP = 0,7 (25 °C), pKa = 11,09 (20 °C).

Растворимость в воде (20 °C) - 0,304 (pH 4), 0,34 (pH 10) г/дм³. Растворимость (г/дм³, 25 °C) в гептане < 0,00104, в ксилоле - 0,028, дихлорметане - 1,32, метаноле - 6,26, октаноле - 0,938, ацетоне - 15,2, этилацетате - 2,03.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность для крыс LD₅₀ > 5 000 мг/кг, ингаляционная токсичность для крыс LC₅₀ (4 ч) > 6,1 мг/л. Не мутаген, не онкоген для крыс и мышей, не тератоген для крыс и кроликов. При прямом контакте опасен для пчел, не опасен при использовании в качестве протравителя и в случае обработок не непосредственно на цветущие культуры.

Область применения. Инсектицид из группы неоникотиноидов для борьбы с сосущими и грызущими насекомыми на рисе, кукурузе, рапсе, овощных и фруктовых культурах. Используется для протравливания семян, обработки почвы и вегетирующей культуры.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении клотианидина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов водным ацетоном, последующей очистки в системе несмешивающихся растворителей и на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация клотианидина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-15.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, владеющий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, имеющий опыт работы, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (смесь N 3) (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

Патрон промывают 2 см³ этилацетата, затем 3 см³ смеси N 1.

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Насыщенный раствор хлористого натрия: в плоскодонную колбу вместимостью 2 дм³ помещают 400 г хлористого натрия, добавляют 1 дм³ теплой дистиллированной воды и перемешивают до окончания растворения соли. Полученный раствор сливают декантацией в чистую колбу, не растворившийся остаток соли отбрасывают.

7.4.1. Основной раствор клотианидина с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску клотианидина (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов. Градуировочные растворы с концентрациями клотианидина 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя исходный раствор и смесь N 3, а также ацетонитрил).

Исходный раствор с концентрацией 2,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,4 см³ основного раствора и доводят до метки смесью N 3.

7.4.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ исходного раствора и доводят объем до метки смесью N 3.

7.4.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,5 см³ исходного раствора и доводят объем до метки смесью N 3.

7.4.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ исходного раствора и доводят объем до метки смесью N 3.

7.4.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ исходного раствора и доводят объем до метки смесью N 3.

7.4.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 1 мкг/см³ (для проверки поведения клотианидина на патроне для ТФЭ): в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора с концентрацией 0,5 мг/см³ и доводят до метки ацетонитрилом.

Основной и исходный раствор клотианидина можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения клотианидина используют ацетонитрильные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация клотианидина в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации клотианидина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации клотианидина в градуировочном растворе;

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации клотианидина в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 25 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора клотианидина в ацетонитриле с концентрацией 1 мкг/см³, приготовленного по п. 7.4.2.5. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см³ смеси N 1 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см³ смеси N 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 10 см³ смеси N 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют 10 см³ этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.2.

Фракции, содержащие клотианидин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 32786-14 "Виноград столовый свежий. Технические условия" и с ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки". Пробы ягод винограда и яблок хранят до анализа в герметично закрытом двойном полиэтиленовом пакете в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 6 месяцев. Пробы виноградного и яблочного сока хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

9.1.1. Экстракция клотианидина из яблок и винограда. Навеску 10 г измельченной матрицы помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см³ и дважды порциями по 30 см³ экстрагируют смесью N 2 в ультразвуковой бане по 10 мин. Экстракт пропускают через химическую воронку, заполненную безводным сульфатом натрия (3 г), и упаривают до водного остатка на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 °C. Водный остаток доводят до 50 см³ насыщенным раствором хлористого натрия, переносят в делительную воронку и дважды порциями по 15 см³ экстрагируют хлористым метиленом. Объединенные органические фракции пропускают через химическую воронку, заполненную безводным сульфатом натрия (3 г) и упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 °C. Сухой остаток чистят на патроне для твердофазной экстракции на основе силикагеля (п. 9.1.3).

9.1.2. Экстракция клотианидина из яблочного и виноградного соков. Навеску 10 г сока доводят до 50 см³ насыщенным раствором хлористого натрия, переносят в делительную воронку и дважды порциями по 15 см³ экстрагируют хлористым метиленом. Объединенные органические фракции пропускают через химическую воронку, заполненную безводным сульфатом натрия (3 г), и упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 °C. Сухой остаток чистят на патроне для твердофазной экстракции на основе силикагеля (п. 9.1.3).

9.1.3. Очистка на патроне для твердофазной экстракции. Сухой остаток, полученный по п. 9.1.1 и п. 9.1.2, растворяют в 1 см³ смеси N 1, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см³ смеси N 1 и так же наносят на патрон. Патрон промывают 10 см³ смеси N 1, элюат отбрасывают. Клотианидин элюируют 8 см³ этилацетата, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила (A) и 0,005 М ортофосфорной кислоты (B) в градиентном режиме: 0 - 1 мин - 5% A, 1 - 8 мин - увеличение A от 5 до 30%, 8 - 10 мин - 30% A, 10 - 10,1 мин - уменьшение A от 30 до 5%, 10,1 - 13 мин - 5% A. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 270 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание клотианидина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика клотианидина на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств клотианидина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор клотианидина с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют смесью N 3.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг, где 0,01 мг/кг - предел обнаружения клотианидина в яблоках).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.