"МУК 4.2.3530-18. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Beauveria bassiana ОРВ-43 в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 01.02.2018)

1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Минздрава России (Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 февраля 2018 г.

4. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Beauveria bassiana ОРВ-43 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

Штамм Beauveria bassiana ОРВ-43 является энтомопатогенным микроорганизмом, выделенным из личинок колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) третьего поколения и прошедшим серию длительных лабораторных пассажей с заражением различных вредителей и последующей реизоляцией. Была проведена идентификация штамма ОРВ-43 на базе ГНУ ВНИИ сельскохозяйственных микроорганизмов Россельхозакадемии с использованием метода секвенирования ITS региона. По результатам работы микроорганизм был отнесен к виду Beauveria bassiana.

Штамм является активным началом препарата Биослип БВ, Ж. Инсектицид "Биослип БВ, Ж" состоит из жизнеспособных бластоспор, конидий, остатков мицелия штамма Beauveria bassiana ОРВ-43 и культуральной жидкости, представляющей собой водный раствор остатков питательной среды и продуктов жизнедеятельности культуры штамма. Содержание жизнеспособных конидий Beauveria bassiana ОРВ-43 в биологическом инсектициде составляет не менее 1 x 10⁸ КОЕ/мл.

Штамм Beauveria bassiana ОРВ-43 является патогеном для широкого спектра насекомых-вредителей, механизм действия которого характеризуется попаданием жизнеспособных конидий и/или бластоспор штамма на поверхность тела насекомого с последующим прорастанием мицелия во внутренние ткани насекомого, сопровождаемым гибелью последнего.

При попадании на покровы насекомых конидии и бластоспоры прорастают сквозь них, образуя мицелий, и постепенно проникают в гемолимфу, где гриб начинает активно размножаться, распространяясь по всему телу насекомого. При этом гриб потребляет растворенные в гемолимфе питательные вещества и продуцирует токсины, в частности, боверин. В результате насекомое гибнет от истощения и интоксикации. Развивающийся мицелий выходит через покровы насекомого на поверхность, на нем образуются споры, которые при попадании на поверхность следующей генерации насекомых заражают их, и цикл повторяется. Штамм не обладает патогенностью в отношении полезных и нейтральных для человека членистоногих в агроценозах.

Систематическое положение штамма

Мицелиальный гриб образует практически одинаковые колонии на среде Сабуро и картофельно-декстрозном агаре, достигающие 25 - 30 мм в диаметре на 10 сутки роста при 23 °C. Колонии войлочные, плотно прилегающие к поверхности среды, белого цвета, обладают слабым невнятным запахом. С возрастом поверхность колоний становится мучнистой. Обратная сторона колонии имеет желтоватую окраску, растворимый пигмент отсутствует.

При микроскопировании обнаруживаются септированные, разветвленные, бесцветные вегетативные гифы с гладкими стенками, 1 - 2 мкм шириной. Конидиеносцы образуются латерально на воздушных гифах.

Конидиогенные клетки расположены одиночно, парами или пучками, с расширенным основанием и тонкой вытянутой вершиной с зигзагообразным недетерминированным рахисом (окончанием), несущим одиночные шаровидные гладкие конидии шириной 2 - 3 мкм.

Конидии бесцветные, несептированные, с тонкими гладкими стенками, имеют размер 2 - 3 мкм, форму, близкую к сферической, иногда со слабозаметной выемкой у основания. В массе конидии белого цвета, агрегированы в сферические кластеры среди воздушного мицелия.

Штамм Beauveria bassiana ОРВ-43 по критериям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации относится к непатогенным микроорганизмам для теплокровных животных. Он не является фитопатогеном, а также не входит в состав 4 групп патогенности в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами" в редакции Дополнений и изменений N 2, утвержденных Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.06.2011 N 86.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50 000 кл./м³.

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений конидий и/или бластоспор гриба на среду Сабуро и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

При выполнении измерений концентрации клеток в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

6.2. СП 1.3.2518-09 Дополнения и изменения N 1 к СП 1.3.2322-08.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.4. Требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

Для приготовления агаризованной среды Сабуро 62 г препарата размешивают в 1 дм³ воды, кипятят до полного растворения препарата и фильтруют через ватно-марлевый тампон. Стерилизуют среду в течение 15 мин при температуре (121 +/- 1) °C. Для подавления роста посторонней микрофлоры ex temporo в готовую и охлажденную до температуры (48 +/- 2) °C среду добавляют канамицин из расчета 50 мкг/мл среды, после чего разливают в чашки Петри.

Среду хранят в герметично закрытой упаковке в помещении с относительной влажностью не более 60% и температурой от 5 до 25 °C.

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением N 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и ГОСТ 8.563-96. "ГСП. Методики выполнения измерений".

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

При выполнении анализа воздуха стерильную среду Сабуро расплавляют, остужают до температуры (48 +/- 2) °C, добавляют канамицин из расчета 50 мкг/мл среды и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °C не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (27 +/- 2) °C. Через 5 - 7 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Beauveria bassiana ОРВ-43 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

где К - концентрация Beauveria bassiana ОРВ-43 в воздухе, кл./м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

C - скорость аспирации воздуха, л/мин;

T - время аспирации, мин.

Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.