"МУК 4.1.3337-16. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств бензовиндифлупира в винограде и виноградном соке, плодах и соке семечковых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 26.02.2016)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 17 декабря 2015 г. N 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 февраля 2016 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации N РОСС RU.0001.310430/0235.17.07.15.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации бензовиндифлупира в винограде и виноградном соке, плодах и соке семечковых культур в диапазоне 0,01 - 0,2 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

N-[(1RS, 4SR)-9-дихлорметилен)-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-метаннафтален-5-ил]-3-дифторметил)-1-(метилпиразол-4-карбоксамид (ИЮПАК).

Эмпирическая формула: C₁₈H₁₅Cl₂F₂N₂O.

Молекулярная масса: 398,2.

Белый порошок без запаха. Температура плавления (148,4 +/- 0,5) °C. Плотность 1,466. Давление паров - менее 3,2 x 10^-9 Па (25 °C). Растворимость в органических растворителях (при 25 °C, в г/дм³): ацетон - 350, дихлорметан - 450, метанол - 76, гексан - 270, октанол - 19, этилацетат - 190, толуол - 48. Растворимость в воде при 25 °C и pH 6,7 - 7,5 - 0,98 мг/дм³. Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода K_OW logP = 4,3 +/- 0,3 (25 °C, pH 6,59). Гидролитически стабилен в стерильном буфере в темноте при pH 4, 5 и 9 до 5 дней (50 °C).

Область применения препарата. Бензовиндифлупир - фунгицид широкого спектра действия, принадлежащий к химическому классу пиразолкарбоксамидов.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении бензовиндифлупира с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после извлечения вещества из анализируемых образцов ягод винограда и плодов семечковых смесью ацетонитрила с водой (80:20, по объему), виноградного и яблочного соков - ацетонитрилом, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоивших данную методику и подтвердивших экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения бензовиндифлупира на ней.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.3.2. Очистка растворителя. Растворитель промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 600 см³ ацетонитрила, добавляют 400 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 0,8 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. Исходный раствор бензовиндифлупира для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0100 г бензовиндифлупира, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике (4 - 6 °C) в течение 3 месяцев.

Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.4.2. Раствор N 1 для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора бензовиндифлупира с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор хранят в холодильнике в течение месяца.

Раствор с концентрацией 10 мкг/см³ используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения веществ методом "внесено-найдено", а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.4.3. Рабочие растворы N 2 - 6 для градуировки (концентрация 0,05 - 1,0 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают по 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрацией бензовиндифлупира 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранят в холодильнике (4 - 6 °C) в течение 2 недель.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации бензовиндифлупира в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 50 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

7.6.1. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 80 см³ гексана и 20 см³ этилацетата, перемешивают.

7.6.2. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 7:3). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 70 см³ гексана и 30 см³ этилацетата, перемешивают.

7.6.3. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 1:1). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 50 см³ гексана и 50 см³ этилацетата, перемешивают.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 30 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают смесью гексан - этилацетат в объемном соотношении 8:2, порцией 20 см³, скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

--------------------------------

<*> Проверку хроматографического поведения бензовиндифлупира следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 бензовиндифлупира с концентрацией 10 мкг/см³, упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Остаток растворяют 1 см³ этилацетата, вносят 4 см³ гексана, помещают на ультразвуковую баню на 30 с. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды смесью гексан - этилацетат (8:2, по объему) порциями по 3 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 25 см³ смеси гексан - этилацетат в объемном соотношении 8:2, затем 50 см³ смеси гексан - этилацетат (7:3), элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 40 см³ смеси гексан - этилацетат (1:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ, анализируют содержание бензовиндифлупира по п. 9.4.

Фракции, содержащие бензовиндифлупир, объединяют и вновь анализируют.

В мерную колбу вместимостью 100 см³, содержащую 50 - 70 см³ деионизованной воды помещают 8,3 см³ концентрированной соляной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают. Хранят при комнатной температуре в течение месяца.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ: виноград - ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия"; плодовые семечковые - ГОСТ 16270-70 "Яблоки свежие ранних сортов созревания. Технические условия"; ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки"; ГОСТ 21713-76 "Груши свежие ранних сортов созревания. Технические условия", ГОСТ 21714-76 "Груши свежие поздних сортов созревания. Технические условия"; ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб", а также "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 5 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом образцы плодов семечковых и винограда измельчают.

Образец измельченных плодов семечковых или ягод винограда массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см³, добавляют 100 см³ смеси ацетонитрил - вода (80:20, по объему), интенсивно встряхивают (вручную) в течение 1 мин, затем помещают на аппарат для встряхивания на 30 мин.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр средней плотности. Растительный остаток дополнительно экстрагируют 80 см³ смеси ацетонитрил - вода (8:1), интенсивно встряхивают 1 мин (вручную), затем помещают на аппарат для встряхивания на 30 мин.

Раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Остаток на фильтре промывают 20 см³ смеси ацетонитрил - вода (8:2). Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр на 250 см³, доводят объем раствора до 200 см³ с помощью бидистиллированной воды, перемешивают, 1/2 часть экстракта (эквивалентную 10 г пробы) переносят в колбу для упаривания на 250 см³, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C до водного остатка (объем 25 - 35 см³). Очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2, затем на колонке с силикагелем по п. 9.3.

Образец сока массой 10 г помещают в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 20 см³ бидистиллированной или деионизованной воды (предварительно обмыв ею колбу, в которой находилась проба), 2 см³ 1 М раствора соляной кислоты и 5 см³ насыщенного хлористого натрия, перемешивают. В делительную воронку вносят 50 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия толщиной 1,5 см, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке. Процедуру экстракции водной фазы повторяют 30 см³ гексана. Объединенный органический экстракт, пропущенный через безводный сульфат натрия, упаривают при температуре 35 °C на ротационном вакуумном растворителе досуха и дополнительно очищают на колонке с силикагелем по п. 9.3.

Водный остаток в колбе, полученный по п. 9.1.1, находящийся в колбе для упаривания, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 20 см³ деионизованной воды (предварительно обмыв ею колбу, в которой находилась проба), 2 см³ 1 М раствора соляной кислоты, 5 см³ насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают.

В делительную воронку вносят 50 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия толщиной 1,5 см, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке. Процедуру экстракции водной фазы повторяют 30 см³ гексана. Объединенный органический экстракт, пропущенный через безводный сульфат натрия, упаривают при температуре 35 °C на ротационном вакуумном растворителе досуха и дополнительно очищают на колонке с силикагелем по п. 9.3.

Остаток, полученный по п. 9.1.2 или 9.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 1 см³ этилацетата, вносят 4 см³ гексана, помещают на ультразвуковую баню на 30 с. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды смесью гексан - этилацетат (8:2, по объему) порциями по 3 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку смесью гексан - этилацетат последовательно в объемных соотношениях: 8:2 - порцией 25 см³, затем 7:3 - порцией 50 см³, элюат отбрасывают.

Бензовиндифлупир элюируют с колонки 30 см³ <*> смеси гексан - этилацетат в объемном соотношении 1:1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 см³, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C.

--------------------------------

<*> Объем элюента может быть изменен в соответствии с результатами проверки хроматографического поведения вещества на колонке по п. 7.8.

Остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы, приготовленной по п. 7.2, и анализируют содержание бензовиндифлупира по п. 9.4.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником, термостатом колонки.

Рабочая длина волны: 254 нм.

Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: 25 °C.

Скорость потока элюента: 0,8 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 50 мм³.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (60:40, по объему).

Линейный диапазон детектирования 2,5 - 50 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2 (не более, чем в 50 раз).

Содержание бензовиндифлупира в пробах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

A - концентрация бензовиндифлупира, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

C - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, C = 1 (яблочный и виноградный соки); C = 2 (виноград, плоды семечковых культур).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание бензовиндифлупира в пробах винограда и виноградного сока, плодов и сока семечковых культур - менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - нижний предел количественного определения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание бензовиндифлупира в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого градуировочного раствора, используемого для контроля, сохраняется соотношение:

X - концентрация бензовиндифлупира в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора бензовиндифлупира, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов бензовиндифлупира, предусмотренных МИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.5.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг.

Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать с последующим уточнением по мере накопления информации на основе выражения:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.