"МУК 4.1.3275-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств абамектина в томатном и яблочном соках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.06.2015)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова, Ж.А. Чистова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 24 июня 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации N РОСС RU.001.310430/0204.31.07.14.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации абамектина в томатном и яблочном соках в диапазоне 0,002 - 0,04 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Смесь 5-O-деметилавермектина A1a (авермектин B1a) и 5-O-деметил-25-де(1-метилпропил)-25-(1-метилэтил)авермектина A1a (авермектин B1b) в соотношении 4:1 (C.A.)

Авермектин B1a - C₄₈H₇₂O₁₄, молекулярная масса - 873,1.

Авермектин B1b - C₄₇H₇₀O₁₄, молекулярная масса - 859,1.

Белый кристаллический порошок без запаха. Температура плавления 161,8 - 169,4 °C (с разложением). Давление паров при 25 °C - менее 3,7 - 10^-3 мПа. Хорошо растворим в хлористом метилене (470 г/дм³), этилацетате (160 г/дм³), ацетоне (72 г/дм³), октаноле (83 г/дм³), толуоле (23 г/дм³), метаноле (13 г/дм³); плохо растворим в гексане (110 мг/дм³) и практически не растворим в воде (1,21 мг/дм³).

Вещество стабильно при нормальных условиях хранения, не гидролизуется в водных растворах при pH 5 - 9. При облучении ультрафиолетовым светом абамектин превращается в 8,9-Z-изомер.

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс и мышей - 10,0 мг/кг и 13,6 мг/кг соответственно; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для кроликов > 2 000 мг/кг.

Абамектин - инсектоакарицид широкого спектра действия, эффективно уничтожат членистоногих, включая клещей и насекомых, на овощных и декоративных культурах, семечковых плодовых, картофеле, сое, табаке и других в течение вегетационного периода.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении абамектина с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектором после извлечения вещества из анализируемых проб томатного и яблочного соков ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, превращения абамектина во флуорогенное производное.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на жидкостном хроматографе, и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление реактива для дериватизации, градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 250 - 300 см³ деионизованной воды, вносят 0,5 см³ ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 950 см³ ацетонитрила и 50 см³ 0,1%-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 30 дней.

Смешивают трифторуксусный ангидрид и свежеперегнанный ацетонитрил в объемном соотношении 1:2. Реактив годен в течение рабочего дня.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 1,0 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.5.1. Исходный раствор абамектина для градуировки (концентрация 100 кг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0103 г абамектина (содержание основного компонента 97,4%), растворяют в 50 - 60 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре ниже -12 °C в течение месяца.

Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.5.2. Раствор N 1 абамектина для градуировки и внесения (концентрация 1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 см³ исходного раствора абамектина с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.5.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре ниже -12 °C в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб томатного и яблочного соков с внесением абамектина при оценке полноты извлечения вещества методом "внесено-найдено", а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.5.3. Рабочие растворы N 2 - 6 абамектина для градуировки (концентрация 0,01 - 0,2 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают по 1,0; 2,0; 5,0; 10 и 20 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией 1 мкг/см³ (п. 7.5.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрацией абамектина 0,01; 0,02; 0,05; 0,1 и 0,2 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранят в морозильной камере при температуре ниже -12 °C в течение месяца.

7.5.4. Рабочие растворы N 2а - 6а флуорогенного производного абамектина для градуировки (соответствуют содержанию абамектина 0,01 - 0,2 мкг). В 5 градуированных пробирок вместимостью 5 см³ вносят по 1 см³ каждого из 5 рабочих растворов абамектина N 2 - 6 (п. 7.5.3), прибавляют по 0,1 см³ 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 - 5 °C, помещая пробирки в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 см³ реактива для дериватизации (приготовленного по п. 7.3), перемешивают и выдерживают 10 - 15 мин при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку вносят ацетонитрил до объема 5 см³, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2а - 6а флуорогенного производного с содержанием абамектина 0,01; 0,02; 0,05; 0,1 и 0,2 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранят в холодильнике (защищенном от света месте) при температуре (4 +/- 2 °C) в течение недели. Срок хранения растворов при комнатной температуре в темноте - не более суток.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (единицы люминесценции - ЕЛ·с) от концентрации абамектина в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам флуорогенного производного абамектина N 2а - 6а для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 50 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

Отбор проб продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб", а также Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 3 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре ниже -18 °C.

К пробе образца томатного или яблочного сока массой 20 г, помещенной в колбу вместимостью 250 см³, приливают 80 см³ ацетонитрила, тщательно перемешивают путем встряхивания, помещают на встряхиватель на 30 мин.

Колбы с экстрактами помещают на 30 мин в морозильную камеру. Затем пробу фильтруют с помощью воронки Бюхнера через двойной бумажный фильтр средней плотности, остаток на фильтре промывают 20 см³ ацетонитрила. Объединенные экстракт и промывку переносят в мерный цилиндр на 100 см³, перемешивают, доводят объем раствора до 100 см³. Аликвоту раствора объемом 50 см³, эквивалентную 10 г пробы сока, переносят в делительную воронку на 250 см³, очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2.

В раствор в делительной воронке, полученный по п. 9.1, вносят 50 см³ дистиллированной воды, 5 см³ насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают. Вносят в воронку 20 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фаз нижний слой сливают в коническую колбу на 150 см³. Верхний органический слой собирают в круглодонную колбу вместимостью 150 см³, фильтруя через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 - 1,2 см, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке. Водно-ацетонитрильную фазу вновь переносят в делительную воронку и повторяют операцию экстракции дважды, используя 15 см³ гексана.

Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой безводного сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 35 °C. Сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила. Аликвоту раствора объемом 1 см³ (¹/₂ часть пробы, эквивалентная 5 г сока) переносят в градуированную пробирку на 5 см³ и подвергают дериватизации по п. 9.3.

К ацетонитрильному раствору прибавляют 0,1 см³ 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 - 5 °C, помещая колбу в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 см³ реактива для дериватизации (п. 7.3), перемешивают и выдерживают 10 - 15 мин при комнатной температуре. Затем в пробирку вносят ацетонитрил до объема 5 см³, тщательно перемешивают.

Дериватизированные экстракты проб томатного и яблочного сока анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с флуориметрическим детектором с переменной длиной волны, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником, термостатом колонки.

Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 5 мкм, предколонка стальная, длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: 35 °C.

Скорость потока элюента: 1,5 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 50 мм³.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1% ортофосфорная кислота (95:5, по объему).

Линейный диапазон детектирования 0,5 - 10 нг.

Пробу вводят в инжектор хроматографа. Устанавливают площадь пика флуорогенного производного абамектина.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор флуорогенного производного абамектина с содержанием абамектина 0,2 мкг, разбавляют ацетонитрилом (не более, чем в 50 раз).

Содержание абамектина в пробах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где A - содержание абамектина, найденное по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика флуорогенного производного, мкг;

m - масса анализируемого образца, г;

B - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, B = 4.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание абамектина в пробах томатного и яблочного сока - менее 0,002 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> - 0,002 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание абамектина в которых должно охватывать весь диапазон от 0,01 до 0,2 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого градуировочного раствора, используемого для контроля, сохраняется соотношение:

где X - содержание абамектина в пробе при контрольном измерении, мкг;

C - известное содержание абамектина в градуировочном растворе, взятом для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флуорогенного производного абамектина, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.6.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг.

Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения с последующим уточнением по мере накопления информации:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.