"МУК 4.1.3512-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифлубензурона в ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" (И.А. Цибульская, А.О. Берестецкий).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.238/01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации дифлубензурона в ягодах и соке винограда в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

1-(4-хлорфенил)-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина (IUPAC).

N-{[(4-хлорфенил)амино]карбонил}-2,6-дифторбензамид (C.A.).

Структурная формула:

Брутто формула: C₁₄H₉ClF₂N₂O₂.

Молекулярная масса: 310,7.

Бесцветное кристаллическое вещество (технический - кристаллы от белых до желтых).

Температура плавления: 228 °C (технический: 210 - 230 °C).

Давление паров при 25 °C: 1,2 x 10^-4 МПа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_owlogP = 3,89.

Растворимость (г/л) при 20 °C: н-гексан - 0,063; толуол - 0,29; дихлорметан - 1,8; метанол - 1,1; вода - 0,08 мг/л (при pH 7 и 25 °C).

Вещество стабильно в кислых средах (20 °C, pH 5 - 7, DT₅₀ > 150 дней), разлагается в щелочных растворах (при pH 9 DT₅₀ 42 дня).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для мышей и крыс - более 4 640 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для кроликов - более 2 000 мг/кг, для крыс - более 10 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - более 2,88 мг/л. Токсичен для пчел. CK₅₀ для рыб 130 - 150 мг/л при экспозиции 96 ч.

Мутагенный и онкогенный эффекты при использовании препарата не наблюдались.

Гигиенические нормативы для дифлубензурона в России:

МДУ для яблок - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата. Несистемный регулятор роста насекомых с контактным и кишечным действием. Используется для уничтожения широкого диапазона насекомых-вредителей, питающихся листьями лесных и плодовых деревьев, а также плодами. Эффективен против яблонной плодожорки, листоверток и др.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении дифлубензурона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектором после его извлечения из образцов ацетонитрилом и очистке экстрактов на патронах для твердофазной экстракции (ТФЭ).

Идентификация дифлубензурона проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-15.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. Для приготовления элюента N 1 смешивают в мерной колбе на 100 см³ 30 см³ ацетонитрила и 70 см³ бидистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

7.2.2. Для приготовления элюента N 2 смешивают в мерной колбе на 100 см³ 80 см³ гексана и 20 см³ диэтилового эфира, используя мерные цилиндры.

7.2.3. Для приготовления элюента N 3 смешивают в мерной колбе на 100 см³ 55 см³ гексана и 45 см³ диэтилового эфира, используя мерные цилиндры.

7.2.4. Для приготовления элюента N 4 смешивают в мерной колбе на 100 см³ 5 см³ ацетонитрила и 95 см³ бидистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

7.2.5. Для приготовления подвижной фазы в мерную колбу на 1 дм³ вносят 600 см³ ацетонитрила и доводят водой объем раствора до метки, встряхивая в течение 2 мин.

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску дифлубензурона (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями дифлубензурона 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил-вода в соотношении 60:40).

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты извлечения дифлубензурона в ягодах и соке винограда используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация дифлубензурона в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе;

C_К - результат контрольного измерения массовой концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

Патрон кондиционируют последовательно промывая элюентом N 3 и гексаном (по 6 см³). В испарительную колбу емкостью 50 см³ отбирают 0,1 см³ раствора дифлубензурона в ацетонитриле концентрации 10 мкг/см³, добавляют 3 см³ элюента N 2 и помещают колбу в ультразвуковую ванну на 2 мин. Раствор вносят в кондиционированный патрон. Колбу обмывают 3 см³ элюента N 2 и также вносят в патрон. Затем патрон промывают 6 см³ элюента N 3. Отбирают фракции по 3 см³ каждая, упаривают, сухой остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ в ультразвуковой ванне (10 с) и анализируют на содержание дифлубензурона по п. 9.3.1.

Фракции, содержащие дифлубензурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 9.3.1. Рассчитывают содержание дифлубензурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Патрон с гидрофобным сорбентом с привитыми гексадецильными группами кондиционируют, последовательно промывая ацетонитрилом и водой (по 6 см³).

В круглодонную колбу емкостью 50 см³ вносят 10 см³ воды, добавляют 0,1 см³ раствора дифлубензурона в ацетонитриле концентрации 10 мкг/см³, перемешивают и полученную смесь вносят в кондиционированный патрон. Патрон промывают 6 см³ элюента N 4 и 6 см³ ацетонитрила. Отбирают фракции по 3 см³ каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ в ультразвуковой ванне (10 с) и анализируют на содержание дифлубензурона по п. 9.3.2. Фракции, содержащие дифлубензурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 9.3.2. Рассчитывают содержание дифлубензурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: профиль вымывания дифлубензурона с патрона может меняться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 32786-14 "Виноград столовый свежий. Технические условия". Пробы ягод винограда хранят до анализа в герметично закрытом двойном полиэтиленовом пакете в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 6 месяцев. Пробы виноградного сока хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

9.1.1. Экстракция. Для экстракции дифлубензурона навеску ягод массой (10 +/- 0,1) г помещают в 50 см³ пробирку, добавляют 30 см³ ацетонитрила, измельчают, перемешивают 1 - 2 мин вручную либо на встряхивателе, центрифугируют 10 мин при 4 000 об./мин, супернатант декантируют в мерный цилиндр на 100 см³. Экстракцию повторяют два раза. Объем объединенных растворов доводят ацетонитрилом до 100 см³. Для последующего анализа отбирают 20 см³ раствора (или аликвоту 20% экстракта) и переносят в испарительную колбу объемом 50 см³. Растворитель упаривают из полученного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пунктам 9.1.2 и 9.1.3.

9.1.2. Очистка на патроне с привитыми гексадецильными группами. Экстракт растворяют в 2 см³ ацетонитрила и добавляют 8 см³ воды. Кондиционируют патрон как описано в п. 7.6 и вводят в него экстракт (скорость потока не более 2 мл/мин). Обмывают колбу с остатком экстракта элюентом N 1 (12 см³), промывают патрон этим раствором, элюат отбрасывают. Патрон подсушивают током воздуха 1 мин. Аналит смывают в испарительную колбу объемом 50 см³ ацетонитрилом (объем 3 см³). Растворитель отгоняют из полученного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. Далее очистку экстракта проводят по п. 9.1.3.

9.1.3. Очистка на патроне с гидрофильным сорбентом с постоянной активностью. Патрон кондиционируют по п. 7.5. Экстракт, очищенный по п. 9.1.2, растворяют в 2 см³ элюента N 2 и вносят в кондиционированный патрон. Колбу обмывают 5 см³ элюента N 2 и также вносят в патрон. Элюат отбрасывают. Аналит смывают элюентом N 3 (3 см³) в испарительную колбу объемом 50 см³. Растворитель упаривают из полученного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C.

Для проведения анализа растворяют сухой остаток в 1,2 см³ ацетонитрила в ультразвуковой ванне (10 с) и добавляют 0,8 см³ воды. После перемешивания в ультразвуковой ванне (10 с) 10 мм³ раствора вводят в хроматограф и проводят анализ по п. 9.3.

Патрон с привитыми гексадецильными группами кондиционируют как описано в п. 7.6 и вносят в него 2 см³ сока (скорость вытекания раствора с патрона должна быть не более 2 см³/мин). Промывают колбу с остатком сока и картридж 6 см³ элюента N 4, а затем 6 см³ элюента N 1. Патрон подсушивают током воздуха 1 мин. Аналит смывают в испарительную колбу объемом 50 см³ ацетонитрилом (объем 3 см³). Растворитель упаривают из полученного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C.

Для проведения анализа растворяют сухой остаток в 1,2 см³ ацетонитрила в УЗ-ванне (10 с) и добавляют 0,8 см³ воды. После перемешивания в УЗ-ванне (10 с) 10 мм³ раствора вводят в хроматограф и проводят анализ по п. 9.3.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой алкильной цепью С18, модифицированной монофункциональной полярной группой, (50 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и воды в соотношении 60:40 (по объему). Скорость потока элюента: 0,25 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 260 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³. Время удерживания дифлубензурона (1,50 +/- 0,07) мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание дифлубензурона в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где S_x - площадь пика дифлубензурона на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения дифлубензурона, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств дифлубензурона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дифлубензурона 1 мкг/см³ разбавляют подвижной фазой.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг*, где * 0,01 мг/кг - предел обнаружения дифлубензурона в ягодах винограда).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.