"МУК 4.2.3528-18. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Corynebacterium glutamicum H150 (Brevibacterium flavum) ВКПМ В-12692 в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 01.02.2018)

1. Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (проф., д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 февраля 2018 г.

4. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Corynebacterium glutamicum H150 (Brevibacterium flavum) ВКПМ В-12692 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентрации от 50 до 500 000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

Штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) H150 происходит от одноименного штамма ВКПМ В-12504, продуцент лизина, не является генетически-инженерно-модифицированным штаммом.

Corynebacterium относится к роду бактерий и порядку Actinomycetales. Виды этого рода являются грамм положительными аэробными микроорганизмами и представлены неподвижными овальными или слегка удлиненными палочками, которые не образуют спор.

Штамм растет в средах, обогащенных углеводами: МПА, L-среда, 2LB-среда с мальтозой (20,0 г/л). Колонии интенсивно желтого цвета округлой формы, приподняты над поверхностью, края колоний ровные, консистенция нетягучая, клетки легко отделяются друг от друга. Оптимальная температура - 30 °C, время выращивания - 1 - 2 сут.

Депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика под номером ВКПМ В-12692.

Штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) H150 ВКПМ В-12692 не является фито- и зоопатогенным, а также не входит в состав 4 групп патогенности в соответствии с Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами" в редакции Дополнений и изменений 2, утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.06.2011 N 86.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50 000 кл/м³.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

При выполнении измерений концентрации клеток бактерий в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Санитарные правила "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней", СП 1.3.2322-08.

6.2. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2518-09.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.4. Требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

Для приготовления среды 2LB используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1 000 см³): триптон - 20,0 г; 50%-я патока мальтозная - 20,0 г; дрожжевой экстракт - 10,0 г; агар-агар - 15,0 г; натрий хлористый - 10,0 г; дистиллированная вода - 1 000 см³.

Сухие компоненты растворяют в 1 000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C в течение 10 дней, не более. Раствор мальтозы 50%-й готовится и стерилизуется отдельно. При разливе среды в чашки Петри добавляется из расчета 40 мл/л 50%-я мальтоза.

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и ГОСТ 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (2LB) расплавляют, остужают до 50 - 60 °C и разливают в чашки Петри. Затем добавляют из расчета 40 мл/л стерилизованный 50%-й раствор мальтозы.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре 2 - 8 °C не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (30 +/- 2) °C. Через 1 - 3 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) H150 ВКПМ В-12692 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

Расчет концентрации клеток проводят по формуле:

К - концентрация штамма в воздухе, кл/м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.

Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.