"МУК 4.1.3160-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовых концентраций фталатов (диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата) в молоке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.02.2014)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (Т.С. Уланова, Н.В. Зайцева, Т.Д. Карнажицкая, Е.О. Пшеничникова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 26 декабря 2013 г. N 4).

3. Утверждены Врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 24 февраля 2014 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации N 88-16374-243-01.00076-2012 от 26.11.2012.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовых концентраций фталатов (диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата) в молоке (молоко сырое, пастеризованное, ультрапастеризованное, стерилизованное, топленое, молоко цельное, обезжиренное, питьевое) <*> в диапазоне концентраций 0,1 - 4,0 мг/дм³ для диметилфталата и ди(2-этилгексил)фталата, 0,2 - 4,0 мг/дм³ для диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата.

--------------------------------

<*> Термины и определения приведены в соответствии с ГОСТ Р 52738-2007.

1.2. Методические указания по измерению массовых концентраций фталатов в молоке предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и других служб, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также других лабораторий, аккредитованных в установленном порядке.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

Фталаты - диэфиры 1,2-бензолдикарбоновой кислоты (o-фталевой кислоты). Общая формула C₈H₄O₄R₁R₂, где R - спиртовый остаток. Фталаты добавляют в качестве пластификаторов для придания эластичности в полимерные материалы при изготовлении предметов промышленного, бытового, пищевого и медицинского назначения. Гигиенические нормативы в Российской Федерации не установлены.

Диметилфталат (ДМФ), диэтилфталат (ДЭФ), дибутилфталат (ДБФ), бензилбутилфталат (ББФ) - бесцветные маслянистые жидкости без запаха или со слабым запахом, ди(2-этилгексил)фталат (ДЭГФ) - прозрачная бесцветная жидкость со слабым запахом.

Фталаты проявляют мутагенный, эмбриотоксический и репротоксический эффекты, снижают активность гормонов печени. Ди(2-этилгексил)фталат является эндокринным дизраптором, нарушающим гормональный метаболизм, обладает канцерогенными свойствами [4].

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значения погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышают значений, приведенных в табл. 1.

4.1. Измерение массовых концентраций диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата основано на двойной экстракции фталатов из молока смесью растворителей (метанола, гексана, изопропанола), очистке экстракта и последующем анализе экстракта на жидкостном хроматографе с использованием диодно-матричного детектора.

4.2. Определению не мешают o-фталевая кислота и ее изомеры.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают указанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений.

6.1. При выполнении измерений следует соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на эксплуатацию жидкостного хроматографа.

6.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по - ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоивших метод измерений и получивших удовлетворительные результаты оперативного контроля процедуры измерений.

8.1. При подготовке к проведению измерений и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление (630 - 800) мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80%.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией прибора.

При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

Используемую посуду вымыть с поверхностно-активным моющим средством, замочить на 1 ч в хромовой смеси, промыть проточной водой, ополоснуть дистиллированной водой, высушить в сушильном шкафу при температуре 105 °C. Перед использованием сухую посуду обработать ацетонитрилом, высушить при комнатной температуре.

9.2.1. Элюент для хроматографии. Смесь ацетонитрила с дистиллированной водой. Состав элюента задают на двух каналах насоса в градиентном и изократическом (для ди(2-этилгексил)фталата) режимах.

9.2.2. Исходный раствор диметилфталата для градуировки. Навеску диметилфталата массой (0,250 +/- 0,001) г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят до метки ацетонитрилом и перемешивают. Массовая концентрация диметилфталата в исходном растворе составляет 2,50 мг/см³. Срок хранения раствора 3 месяца при температуре 4 °C.

9.2.3. Исходный раствор диэтилфталата для градуировки. Навеску диэтилфталата массой (0,250 +/- 0,001) г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят до метки ацетонитрилом и перемешивают. Массовая концентрация диэтилфталата в исходном растворе составляет 2,50 мг/см³. Срок хранения раствора 3 месяца при температуре 4 °C.

9.2.4. Исходный раствор дибутилфталата для градуировки. Навеску дибутилфталата массой (0,250 +/- 0,001) г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят до метки ацетонитрилом и перемешивают. Массовая концентрация дибутилфталата в исходном растворе составляет 2,50 мг/см³. Срок хранения раствора 3 месяца при температуре 4 °C.

9.2.5. Исходный раствор бензилбутилфталата для градуировки. Навеску бензилбутилфталата массой (0,250 +/- 0,001) г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят до метки ацетонитрилом и перемешивают. Массовая концентрация бензилбутилфталата в исходном растворе составляет 2,50 мг/см³. Срок хранения раствора 3 месяца при температуре 4 °C.

9.2.6. Исходный раствор ди(2-этилгексил)фталата для градуировки. Навеску ди(2-этилгексил)фталата массой (0,250 +/- 0,001) г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят до метки ацетонитрилом и перемешивают. Массовая концентрация ди(2-этилгексил)фталата в исходном растворе составляет 2,50 мг/см³. Срок хранения раствора 3 месяца при температуре 4 °C.

9.2.7. Раствор для идентификации диметилфталата. В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят микрошприцем 2,5 мкл исходного раствора диметилфталата для градуировки и доводят содержимое колбы ацетонитрилом до метки. Массовая концентрация диметилфталата составляет 0,25 мг/дм³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.2.8. Раствор для идентификации диэтилфталата. В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят микрошприцем 2,5 мкл исходного раствора диметилфталата для градуировки и доводят содержимое колбы ацетонитрилом до метки. Массовая концентрация диэтилфталата составляет 0,25 мг/дм³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.2.9. Раствор для идентификации дибутилфталата. В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят микрошприцем 25 мкл исходного раствора дибутилфталата для градуировки и доводят содержимое колбы ацетонитрилом до метки. Массовая концентрация дибутилфталата составляет 2,5 мг/дм³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.2.10. Раствор для идентификации бензилбутилфталата. В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят микрошприцем 2,5 мкл исходного раствора бензилбутилфталата для градуировки и доводят содержимое колбы ацетонитрилом до метки. Массовая концентрация бензилбутилфталата составляет 0,25 мг/дм³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.2.11. Раствор для идентификации ди(2-этилгексил)фталата. В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят микрошприцем 2,5 мкл исходного раствора ди(2-этилгексил)фталата для градуировки и доводят содержимое колбы ацетонитрилом до метки. Массовая концентрация ди(2-этилгексил)фталата составляет 0,25 мг/дм³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.2.12. Хромовая смесь. В термостойкий стакан вместимостью 2 дм³ насыпают 50 г калия двухромовокислого, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дм³ концентрированной серной кислоты.

Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюент со скоростью 1,0 см³/мин до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

9.4.1. Градуировочные характеристики, выражающие зависимости площадей пиков на хроматограмме (единицы оптической плотности, е.о.п.) от массовых концентраций диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата, устанавливают на градуировочных растворах диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в молоке методом абсолютной градуировки. Градуировочную характеристику для определения диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата устанавливают по результатам измерений трех серий из пяти градуировочных растворов с различными массовыми концентрациями определяемых фталатов в каждой серии. Градуировочную характеристику для определения диметилфталата, ди(2-этилгексил)фталата устанавливают по результатам измерений трех серий из шести градуировочных растворов с различными массовыми концентрациями определяемых фталатов в каждой серии.

9.4.2. Градуировочные растворы готовят в мерных колбах вместимостью 25 см³. Для этого в каждую колбу вносят исходный раствор для градуировки в соответствии с табл. 2, доводят молоком до метки и перемешивают содержимое колбы. В соответствии с п. 10 проводят анализ молока на содержание фталатов. При наличии анализируемых веществ в холостой пробе вычитают их фоновое содержание при построении градуировочного графика.

9.4.3. В вакуумную стеклянную пробирку вместимостью 6 см³ переносят 1,5 см³ каждого градуировочного раствора определяемых фталатов, добавляют 3,6 см³ смеси метанол-гексан-изопропанол (1,5:2,0:0,1), закрывают пробкой, интенсивно перемешивают в течение 5 мин. Содержимое пробирки центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 2 000 оборотов в минуту. После расслоения жидкостей верхний слой (экстракт 1) переносят в новую вакуумную пробирку. Проводят повторную экстракцию молока, добавляя к нижнему слою 3,6 см³ смеси метанол-гексан-изопропанол (1,5:2:0,1), интенсивно перемешивая и центрифугируя смесь в течение 10 мин. Отбирают верхний слой (экстракт 2). Объединенный экстракт высушивают в токе воздуха, сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила, очищают от молочного жира, для чего добавляют в пробирку 1 см³ гексана, закрывают пробкой, тщательно перемешивают в течение 1 мин. После расслоения жидкостей гексановый (верхний) слой удаляют, а ацетонитрильный (нижний) слой фильтруют через капроновый фильтр, используя медицинский шприц типа "Луер", в стеклянную виалу и аликвотную часть (20 мм³) анализируют на жидкостном хроматографе в условиях хроматографирования.

9.4.4. Условия хроматографирования:

колонка 2,1 мм x 150 мм, заполненная сорбентом C18;

подвижная фаза для анализа диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата - смесь ацетонитрила и воды в градиентном режиме: увеличение ацетонитрила с 37 до 40% от 0 до 1 мин, увеличение ацетонитрила с 40 до 75% от 1 до 3 мин, уменьшение ацетонитрила с 75 до 50% от 3 до 4 мин, увеличение ацетонитрила с 50 до 90% от 4 до 6 мин, уменьшение ацетонитрила с 90 до 37% от 6 до 10 мин;

подвижная фаза для анализа ди(2-этилгексил)фталата - смесь ацетонитрила и воды в соотношении 85:15;

9.4.5. Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

C_i - массовые концентрации диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в градуировочном растворе, мг/дм³;

S_i - среднее значение трех измерений площади пика диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата i-й концентрации, расхождение между минимальным и максимальным значением из которых не должно превышать 4% относительно среднего значения S_i, единицы оптической плотности (е.о.п.);

n - количество градуировочных растворов.

9.4.6. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация концентрации диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировочная характеристики признается стабильной при выполнении условия:

C - заданная массовая концентрация диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в градуировочном растворе;

C_m - результат измерения массовой концентрации диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в образце для градуировки.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

Отбор проб молока осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ 3622-68. Отобранные образцы упаковывают в стеклянные банки с притертыми крышками. Срок хранения проб до 3 суток при температуре 4 °C, более 3 суток - при температуре -15 °C.

10.2.1. Выполняют два параллельных измерения массовой концентрации диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в пробе молока. В стеклянную вакуумную пробирку вместимостью 6 см³ добавляют 1,5 см³ анализируемого молока, добавляют 3,6 см³ смеси растворителей (метанол, гексан и изопропанол в объемном отношении 1,5:2,0:0,1), закрывают пробкой, интенсивно перемешивают в течение 5 мин. Содержимое пробирки центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 2 000 оборотов в минуту. После расслоения жидкостей верхний слой (экстракт 1) переносят в новую стеклянную пробирку. Нижний слой повторно экстрагируют: снова добавляют 3,6 см³ смеси растворителей (метанол, гексан и изопропанол в объемном отношении 1,5:2,0:0,1), закрывают пробкой, интенсивно перемешивают в течение 5 мин. Содержимое пробирки центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 2 000 оборотов в минуту. После расслоения жидкостей отбирают верхний слой (экстракт 2). Экстракты объединяют и высушивают в токе воздуха. Сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила и очищают от молочного жира, для чего добавляют в пробирку 1 см³ гексана, закрывают пробкой, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, центрифугируют 10 мин. После расслоения жидкостей гексановый (верхний) слой удаляют, а ацетонитрильный (нижний) слой фильтруют через капроновый фильтр, используя медицинский шприц типа "Луер", в стеклянную виалу. Аликвотную часть (20 мм³) анализируют на жидкостном хроматографе в условиях, указанных в п. 9.4.4.

10.2.2. Выполняют измерение фонового содержания фталатов в объеме экстрагента, взятого на анализ. С этой целью 7,2 см³ смеси растворителей (метанол, гексан и изопропанол в объемном отношении 1,5:2,0:0,1), используемой для двойной экстракции фталатов из молока, переносят в стеклянную пробирку вместимостью 6 см³, высушивают в токе воздуха, сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила. Раствор фильтруют через капроновый фильтр, используя медицинский шприц типа "Луер", в стеклянную виалу и аликвотную часть (20 мм³) анализируют на жидкостном хроматографе в условиях, указанных в п. 9.4.4. Измерение холостой пробы экстрагента выполняют при анализе каждой серии образцов молока.

10.2.3. Идентификацию диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата проводят путем сравнения времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и в растворах для идентификации ди(2-этилгексил)фталата, приготовленных по пп. 9.2.7 - 9.2.11.

11.1. Массовые концентрации диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в молоке (мг/дм³) вычисляют по формуле:

C_i - массовые концентрации диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в анализируемой пробе, мг/дм³;

S_i - площадь пика диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в анализируемой пробе, е.о.п.;

S_хол - площадь пика диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в холостой пробе, е.о.п.;

K - градуировочный коэффициент.

11.2. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости C₁, C₂ (параллельных определений), для которых выполняется условие:

r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (1) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

CR_0,95(4) - критический диапазон. Значения критического диапазона приведены в табл. 3. При невыполнении условия (2) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условия (1).

11.3. Расхождение между результатами измерений, полученных в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости:

и - результаты измерений массовой концентрации диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата, полученные в разных лабораториях - средние арифметические двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие (1).

При выполнении условия (3) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значение предела воспроизводимости приведено в табл. 3. При невыполнении условия (3) могут быть проведены процедуры проверки приемлемости согласно раздела 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

Результат измерений представляют в виде , где

- результат измерений, мг/дм³;

- характеристика погрешности, мг/дм³ при P = 0,95;

значение рассчитывают по формуле: , где значение приведено в табл. 1.

Обеспечение достоверности измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)-2002 и РМГ 76-2004.

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

- результат измерений массовой концентрации диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (1);

- результат измерений массовой концентрации диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (1).

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

, - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Образцами для контроля внутрилабораторной прецизионности являются пробы исследуемого молока (рабочие пробы).

При реализации контрольной процедуры получают два результата контрольных измерений (первичного и повторного ) массовой концентрации диметилфталата, диэтилфталата, дибутилфталата, бензилбутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:

Значение предела внутрилабораторной прецизионности R_л приведено в табл. 4.

При невыполнении условия (3) процедуру повторяют. При повторном превышении предела внутрилабораторной прецизионности выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.