"МУК 4.2.3437-17. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Микробиологическое измерение концентрации Trichoderma asperellum OPF-19 в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 22.02.2017)

1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Минздрава России (Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 февраля 2017 г.

4. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Trichoderma asperellum OPF-19 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

Мицелиальный гриб Trichoderma asperellum OPF-19 является действующей субстанцией фунгицида "Оргамика Ф, Ж" (титр не менее 1 x 10⁸ КОЕ/мл).

Источником выделения штамма является поверхность корней томатов, выращенных в условиях открытого грунта в Высокогорском районе Республики Татарстан.

Штамм отличается наличием широкого спектра антагонистической активности по отношению к фитопатогенным грибам, является быстрорастущим как в условиях in vitro, так и в естественной среде. Штамм проявляет способность эффективно колонизировать поверхность корней растений.

Культурально-морфологические признаки. Растет на агаризованных средах (Мальц-агар, среда Чапека с дрожжевым автолизатом, сусло-агар, глюкозо-картофельный агар, среда Сабуро) при температуре 29 - 34 °C в течение 7 суток, pH 3,5 - 5,0.

После 72 часов роста на глюкозо-картофельном агаре при температуре 30 °C колония штамма T. asperellum OPF-19 имеет максимальный диаметр 55 - 65 мм. Колонии образуют несколько концентрических колец, на поверхности которых заметно интенсивное спороношение.

В центральной части колония более темная, она раньше, чем периферия приобретает зеленую окраску. По мере удаления от центра формируется воздушный мицелий. При культивировании при температуре 25 °C в отсутствие света, конидии формируются через 35 - 45 часов. Диффузии пигмента в агар не происходит, у старых колоний присутствует слабый специфический запах.

При росте на агаризованной среде Сабуро в течение 5 суток при температуре 25 °C конидиальная зона сформирована конидиеносцами, сгруппированными в коремии и спородохии, имеющими вид многочисленных компактных подушечек диаметром до 2 мм, изначально белого цвета, с возрастом - зеленого. Подушечки образуются по всей поверхности колонии, обильно.

Конидиеносцы чаще формируются в подушечках и редко на воздушном мицелии, конидиеносцы симметричные, завершаются четырьмя фиалидами. Парные ответвления формируются ниже верхушки конидиеносца и располагаются под углом около 90° по отношению к основной оси. Первичные ветки по мере удаления от верхушки удлиняются, парные ответвления имеют одинаковую длину, на боковых ветвях первого порядка формируются неветвящиеся боковые ветви второго порядка. Ширина конидиеносца - 2,1 - 5,0 мкм.

Фиалиды образуются на концах ветвей первого и второго порядка, образуются скопления из 2 - 4 фиалид. Фиалиды прямые, колбовидные, немного расширенные в середине, длина - 5 - 10 мкм, ширина - 2,2 - 5,7 мкм. Интеркалярные фиалиды не формируются. Конидии имеют темно-зеленый цвет, форма - немного яйцевидная, часто ближе к шаровидной, диаметр - 3,5 - 4 мкм.

Штамм Trichoderma asperellum OPF-19 по критериям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации относится к непатогенным для теплокровных животных микроорганизмов.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50 000 кл./м³.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений бактерий на среду Сабуро и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

При выполнении измерений концентрации клеток в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней: СП 1.3.2322-08.

6.2. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения N 1 к СП 1.3.2322-08: СП 1.3.2518-09.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

Для приготовления агаризованной среды Сабуро 62 г препарата размешивают в 1 дм³ воды, кипятят до полного растворения препарата и фильтруют через ватно-марлевый тампон. Стерилизуют среду в течение 15 мин при температуре (121 +/- 1) °C. Для подавления роста посторонней микрофлоры в готовую и охлажденную до температуры (48 +/- 2) °C среду добавляют по 100 мг бензилпенициллина и тетрациклина, после чего разливают в чашки Петри.

Среду хранят в герметично закрытой упаковке в помещении с относительной влажностью не более 60% и температурой от 5 до 25 °C.

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением N 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и ГОСТ 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенки прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

При выполнении анализа воздуха стерильную среду Сабуро расплавляют, остужают до температуры (48 +/- 2) °C и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °C не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (27 +/- 2) °C. Через 1 - 2 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Trichoderma asperellum OPF-19 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери заданных ей ростовых свойств.

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

К - концентрация Trichoderma asperellum OPF-19 в воздухе, кл./м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.

Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.