"МУК 4.1.3522-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в воде, почве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, Е.Н. Тестова, Р.А. Стрелецкий).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2017 г.

4. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для определения массовых концентраций флутоланила и его метаболитов, содержащих 2-трифторметилбензойные кислотные группы (M-2, M-4, M-101 и M-102) в воде в диапазоне 0,001 - 0,010 мг/дм³ и в почве в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг, а также уровня их остаточных количеств в клубнях картофеля в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг. Методические указания носят рекомендательный характер.

, , -трифтор-3'-изопропокси-орто-толуанилид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₇H₁₆F₃NO₂.

Молекулярная масса: 323,34.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: белого цвета.

Давление паров: 4,1 x 10^-4 МПа (25 °C).

Коэффициент распределения октанол/вода (при pH 7, 20 °C): K_ow logP = 3,17.

Температура плавления: 104,6 °C.

Растворимость в воде (мг/дм³, 20 °C): 8,01.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, при 20 °C): ацетон - 606; этилацетат - 365; метанол - 322; толуол - 35.

Гидролитически стабилен при pH от 5 до 9.

Устойчив в почве, ДТ₅₀: 233 дня.

Краткая токсикологическая характеристика. Флутоланил относится к мало опасным веществам по острой пероральной (ЛД₅₀ для крыс более 10 000 мг/кг) и по дермальной токсичности (ЛД₅₀ для крыс более 5 000 мг/кг массы тела) и к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 часа) более 5 980 мг/м³). Не раздражает слизистую глаз и кожу кроликов.

Область применения. Флутоланил - фунгицид из класса оксатиинов системного действия. Ингибирует комплекс сукцинатдегидрогеназы базидиомицетов. Сукцинатдегидрогеназа представляет собой белковый комплекс, который является составной частью внутренней митохондриальной мембраны и ключевым элементом в цепи переноса электронов млекопитающих.

В России установлены следующие гигиенические нормативы: ВДСД - 0,09 мг/кг массы тела человека.

ВМДУ для импортируемой продукции (мг/кг): рис - 2,0; картофель - 0,1.

, , -трифтор-4'-гидрокси-3'-изопропокси-орто-толуанилид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₇H₁₆F₃NO₃.

Молекулярная масса: 339,31.

, , -трифтор-3'-гидрокси-орто-толуанилид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₄H₁₀F₃NO₂.

Молекулярная масса: 281,23.

2-(трифторметил)бензамид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₈H₆F₃NO.

Молекулярная масса: 189,13.

2-(трифторметил)бензойная кислота.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₈H₅F₃O₂.

Молекулярная масса: 190,12.

ВМДУ в импортируемой продукции (мг/кг): рис - 2,0; картофель - 0,1.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием тандемного масс-спектрометрического детектора (ВЭЖХ-МС-МС).

Определение флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в воде проводится после их экстракции хлористым метиленом из подкисленного образца воды.

Определение флутоланила и его метаболитов M-2, M-4 и M-101 в почве проводится после их экстракции подкисленным ацетонитрилом и дальнейшего концентрирования и разбавления полученного экстракта.

Определение метаболита флутоланила M-102 в почве проводится после его экстракции подкисленным ацетонитрилом и дальнейшей очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами.

Определение флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в клубнях картофеля проводится после их экстракции подкисленным ацетонитрилом и дальнейшего концентрирования и разбавления полученного экстракта.

Идентификация флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 проводится по времени удерживания, наличию характеристических ионов в масс-спектрах хроматографически выделенных веществ и соотношению интенсивностей (площадей) пиков, отвечающих характеристическим ионам идентифицируемых компонентов и аналитических стандартов на регистрируемых ионных масс-хроматограммах. Концентрацию флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 определяют по площадям соответствующих хроматографических пиков на ионных масс-хроматограммах по методу абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность метода достигается за счет использования масс-спектрометрического детектора, регистрирующего одновременно несколько специфичных дочерних ионов, характеризующих вещество.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на комплекс жидкостного хроматографа с масс-спектрометрическим детектором.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 часов.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

Хлористый метилен промывают равным объемом 5%-го раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 часов. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °C, отбрасывают.

7.2.1.1. Приготовление 5%-го раствора гидрокарбоната натрия

В мерную колбу на 1 000 см³ переносят 50 г гидрокарбоната натрия, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

7.2.1.2. Приготовление подкисленного ацетонитрила для экстракции

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ ацетонитрила, прибавляют 10,0 см³ муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки ацетонитрилом.

7.2.1.3. Приготовление 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ бидистиллированной воды, прибавляют 1,0 см³ муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки бидистиллированной водой. Раствор используется как компонент подвижной фазы.

7.2.1.4. Приготовление 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ ацетонитрила, прибавляют 1,0 см³ муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки ацетонитрилом. Раствор используется как компонент подвижной фазы.

7.2.1.5. Приготовление 10 мМ водного раствора гидроксида аммония (по аммиаку)

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ бидистиллированной воды, прибавляют 0,75 см³ 25%-го раствора гидроксида аммония, перемешивают, объем доводят до метки бидистиллированной водой. Раствор используется как компонент подвижной фазы.

7.2.1.6. Приготовление 10 мМ раствора гидроксида аммония в ацетонитриле

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ ацетонитрила, прибавляют 0,75 см³ 25%-го раствора гидроксида аммония, перемешивают, объем доводят до метки ацетонитрилом. Раствор используется как компонент подвижной фазы.

7.2.1.7. Приготовление 6 М раствора соляной кислоты

Мерным цилиндром отбирают 246 см³ концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 500 см³, куда предварительно наливают около 100 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией флутоланила 1,0 мг/см³

Взвешивают 10 мг флутоланила в мерной колбе объемом 10 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.2.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией M-2 1,0 мг/см³

Взвешивают 10 мг M-2 в мерной колбе объемом 10 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 2 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией M-4 1,0 мг/см³

Взвешивают 10 мг M-4 в мерной колбе объемом 10 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 3 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией M-101 1,0 мг/см³

Взвешивают 10 мг M-101 в мерной колбе объемом 10 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 4 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 4 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией M-102 1,0 мг/см³

Взвешивают 10 мг M-102 в мерной колбе объемом 10 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 5 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 5 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.2.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией флутоланила, M-2, M-4, M-101 и M-102 по 10,0 мкг/см³

Из стандартных растворов N 1, 2, 3, 4 и 5 отбирают пипеткой по 1 см³ каждого раствора и помещают в мерную колбу объемом 100 см³. Доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор N 6 используется для приготовления стандартных растворов для внесения в контрольные образцы. Стандартный раствор N 6 хранят в холодильнике не более 2 месяцев.

7.2.2.7. Стандартные растворы флутоланила, M-2, M-4, M-101 и M-102 с концентрацией по 2,0; 1,0; 0,4; 0,2 и 0,1 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы

Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора N 6 готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,4; 0,2 и 0,1 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.

7.2.2.8. Стандартный раствор N 7 с концентрацией флутоланила, M-2, M-4 и M-101 по 10,0 мкг/см³

Из стандартных растворов N 1, 2, 3 и 4 отбирают пипеткой по 1 см³ каждого раствора и помещают в мерную колбу объемом 100 см³. Доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор N 7 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор N 7 хранят в холодильнике не более 2 месяцев.

7.2.2.9. Стандартный раствор N 8 с концентрацией M-102 10,0 мкг/см³

Из стандартного раствора N 5 отбирают пипеткой 1 см³ раствора и помещают в мерную колбу объемом 100 см³. Доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор N 8 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор N 8 хранят в холодильнике не более 2 месяцев.

7.2.2.10. Стандартные растворы флутоланила, M-2, M-4 и M-101 с концентрацией по 0,025; 0,01; 0,005 и 0,002 мкг/см³

Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора N 7 готовят растворы, содержащие по 0,025; 0,01; 0,005 и 0,002 мкг/см³ и используют эти растворы для установления градуировочной зависимости для определения флутоланила и его метаболитов M-2, M-4 и M-101 в воде. Стандартные растворы хранят в холодильнике не более 2 месяцев.

7.2.2.11. Стандартные растворы флутоланила, M-2, M-4 и M-101 с концентрацией по 0,025; 0,01; 0,007 и 0,002 мкг/см³

Методом последовательного разведения стандартного раствора N 7 готовят растворы, содержащие по 0,025; 0,01; 0,007 и 0,002 мкг/см³ и используют эти растворы для установления градуировочной зависимости для определения флутоланила и его метаболитов M-2, M-4 и M-101 в почве. Стандартные растворы готовятся на основе матрицы, т.е. в качестве растворителя используется очищенный экстракт контрольного образца почвы, подготовленный по п. 9.2. Стандартные растворы хранят в холодильнике не более 7 дней.

7.2.2.12. Стандартные растворы флутоланила, M-2, M-4 и M-101 с концентрацией по 0,025; 0,015; 0,005 и 0,002 мкг/см³

Методом последовательного разведения стандартного раствора N 7 готовят растворы, содержащие по 0,025; 0,015; 0,005 и 0,002 мкг/см³ и используют эти растворы для установления градуировочной зависимости для определения флутоланила и его метаболитов M-2, M-4 и M-101 в клубнях картофеля. Стандартные растворы готовятся на основе матрицы, т.е. в качестве растворителя используется очищенный экстракт контрольного образца клубней картофеля, подготовленный по п. 9.3. Стандартные растворы хранят в холодильнике не более 7 дней.

7.2.2.13. Стандартные растворы M-102 с концентрацией 0,25; 0,1; 0,05 и 0,02 мкг/см³

Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора N 8 готовят растворы, содержащие по 0,25; 0,1; 0,05 и 0,02 мкг/см³ и используют эти растворы для установления градуировочной зависимости для определения M-102 в воде и почве. Стандартные растворы хранят в холодильнике не более 2 месяцев.

7.2.2.14. Стандартные растворы M-102 с концентрацией 0,025; 0,015; 0,005 и 0,002 мкг/см³

Методом последовательного разведения стандартного раствора N 8 готовят растворы, содержащие по 0,025; 0,015; 0,005 и 0,002 мкг/см³ и используют эти растворы для установления градуировочной зависимости для определения M-102 в клубнях картофеля. Стандартные растворы готовятся на основе матрицы, т.е. в качестве растворителя используется очищенный экстракт контрольного образца клубней картофеля, подготовленный по п. 9.3. Стандартные растворы хранят в холодильнике не более 7 дней.

Градуировочные характеристики, выражающие отклик целевых ионов от концентрации флутоланила и его метаболитов в растворе (мкг/см³), устанавливают путем определения соотношения интенсивности (площади) пиков, отвечающих характеристичным ионам идентифицируемого компонента и аналитического стандарта на регистрируемых ионных масс-хроматограммах по 4 растворам для установления градуировочной характеристики.

Градуировочную зависимость для определения флутоланила и его метаболитов M-2, M-4 и M-101 в воде устанавливают по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,025; 0,01; 0,005 и 0,002 мкг/см³ каждого компонента, приготовленным согласно п. 7.2.2.10.

Градуировочную зависимость для определения флутоланила и его метаболитов M-2, M-4 и M-101 в почве устанавливают по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,025; 0,01; 0,007 и 0,002 мкг/см³ каждого компонента, приготовленным согласно п. 7.2.2.11.

Градуировочную зависимость для определения флутоланила и его метаболитов M-2, M-4 и M-101 в клубнях картофеля устанавливают по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,025; 0,015; 0,005 и 0,002 мкг/см³ каждого компонента, приготовленным согласно п. 7.2.2.12.

Градуировочную зависимость для определения M-102 в воде и почве устанавливают по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,25; 0,1; 0,05 и 0,02 мкг/см³, приготовленным согласно п. 7.2.2.13.

Градуировочную зависимость для определения M-102 в клубнях картофеля устанавливают по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,025; 0,015; 0,005 и 0,002 мкг/см³, приготовленным согласно п. 7.2.2.14.

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм³ (при определении флутоланила и его метаболитов M-2, M-4 и M-101) или 10 мм³ (при определении M-102) каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 40 °C 3 - 4 часа.

Отбор проб проводится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 31861-12 "Вода. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 17.4.3.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб", ГОСТ 7176-85 "Картофель свежий продовольственный, заготовляемый и поставляемый. Технические условия", ГОСТ Р 51808-13 "Картофель продовольственный. Технические условия", ГОСТ 26832-86 "Картофель свежий для переработки на продукты питания. ТУ".

Пробы воды хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более 10 суток.

Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Пробы клубней картофеля хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °C в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °C не более 3 лет.

Пробу воды объемом 100 см³ помещают в делительную воронку объемом 250 см³. Добавляют 15 г хлорида натрия и растворяют его путем встряхивания. Подкисляют водную фазу 6 М соляной кислотой до значения pH 2.

Флутоланил и его метаболиты экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 см³ каждая, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 4 см³ ацетонитрила, пробу переносят в виалу объемом 2 см³ для автоматического дозатора проб и 5 мм³ (при определении флутоланила и его метаболитов M-2, M-4 и M-101) или 10 мм³ (при определении M-102) пробы вводят в хроматограф.

При экстракции в каждую банку с пробой и растворителем помещается по 5 шариков для экстракции, которые перед центрифугированием удаляются.

Образец почвы массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 см³, добавляют 50 см³ подкисленного ацетонитрила (п. 7.2.1.2) и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 15 минут на аппарат для встряхивания проб. Затем пробу центрифугируют в течение 5 минут при скорости 4 000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в мерный цилиндр объемом 100 см³. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 20 см³ подкисленного ацетонитрила и помещая пробы на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 15 минут на аппарат для встряхивания проб. Пробы центрифугируют в течение 5 минут при скорости 4 000 оборотов в минуту. Экстракты фильтруют, объединяют в мерном цилиндре объемом 100 см³. Объем экстракта в цилиндре доводят до метки 100 см³ подкисленным ацетонитрилом.

Из объединенного экстракта, подготовленного по п. 9.2.1, берут аликвоту 12,5 см³ (1/8 часть), переносят ее в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают до объема менее 5 см³ на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C.

Сконцентрированный экстракт из концентратора переносят в мерный цилиндр объемом 10 см³. Исходную колбу обмывают порцией ацетонитрила, необходимой для получения общего объема экстракта 5 см³ (5 см³ минус объем экстракта, перенесенного в цилиндр), помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну и объединяют экстракт с предыдущим в мерном цилиндре объемом 10 см³. К ацетонитрильному экстракту в цилиндре добавляют 5 мл 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты.

Пробу переносят в виалу объемом 2 см³ для автоматического дозатора проб и 5 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Из объединенного экстракта, подготовленного по п. 9.2.1, берут аликвоту 50 см³ (1/2 часть), переносят ее в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают до водного остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C.

К водному остатку, полученному по п. 9.2.3, добавляют 20 см³ дистиллированной воды, обмывают стенки концентратора и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Добавляют в делительную воронку 5 г хлорида натрия, растворяя его путем встряхивания.

Метаболит флутоланила M-102 экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 10 см³ каждая, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 4 см³ ацетонитрила, пробу переносят в виалу объемом 2 см³ для автоматического дозатора проб и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Образец измельченных клубней картофеля массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 см³, добавляют 50 см³ подкисленного ацетонитрила (п. 7.2.1.2) и помещают на 30 минут на аппарат для встряхивания проб. Затем пробу центрифугируют в течение 10 минут при скорости 4 000 оборотов в минуту. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в мерный цилиндр объемом 100 см³. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 20 см³ подкисленного ацетонитрила и помещая пробы на 30 минут на аппарат для встряхивания проб. Пробы центрифугируют в течение 10 минут при скорости 4 000 оборотов в минуту. Экстракты фильтруют, объединяют в мерном цилиндре объемом 100 см³. Объем экстракта в цилиндре доводят до метки 100 см³ подкисленным ацетонитрилом.

Из объединенного экстракта, подготовленного по п. 9.3.1, берут аликвоту 12,5 см³ (1/8 часть), переносят ее в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают до объема менее 5 см³ на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C.

Сконцентрированный экстракт из концентратора переносят в мерный цилиндр объемом 10 см³. Исходную колбу обмывают порцией ацетонитрила, необходимой для получения общего объема экстракта 5 см³ (5 см³ минус объем экстракта, перенесенного в цилиндр), помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну и объединяют экстракт с предыдущим в мерном цилиндре объемом 10 см³. К ацетонитрильному экстракту в цилиндре добавляют 5 мл 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты.

Пробу переносят в виалу объемом 2 см³ для автоматического дозатора проб и 5 мм³ (при определении флутоланила и его метаболитов M-2, M-4 и M-101) или 10 мм³ (при определении M-102) пробы вводят в хроматограф.

Система высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектором, включающая:

- модульный жидкостный хроматограф, состоящий из: градиентного насоса на два растворителя, позволяющий регулировать поток элюента от 0,001 до 5,0 см³/мин и создавать давление от 0 до 600 бар; вакуумного дегазатора; термостата колонок с двумя независимо нагреваемыми зонами с диапазоном температур от 10 до 80 °C; автоматического дозатора проб с использованием виал на 2 см³. ВЭЖХ-система соединена с тандемным масс-спектрометрическим детектором типа тройная квадруполь с источником ионизации типа электроспрей и оснащенным двумя высокопроизводительными турбомолекулярными насосами, позволяющим регистрировать отдельные ионы с заданными массами от 5 до 3 000 а.е.м.

- компьютерную систему обработки данных, контролирующую работу всего прибора, обеспечивающую сбор и хранение всех масс-хроматограмм в процессе проведения хромато-масс-спектрометрического анализа, обеспечивающую обработку результатов измерений, вывод и расчет масс-хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая стальная длиной 100 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 3,5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Предколонка хроматографическая стальная длиной 12,5 мм, с внутренним диаметром 2,1 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Температура колонки: 40 °C.

Подвижная фаза: 0,1%-й водный раствор муравьиной кислоты - 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле (%, по объему) в градиентном режиме. Градиент потока элюента: 0 мин - 50:50, скорость потока элюента - 0,3 см³/мин; с 1-й по 10-ю мин - 0:100, скорость потока элюента - 0,3 см³/мин; с 10,5-й до 12,5-й мин - 0:100, скорость потока элюента - 1 см³/мин; 13-я мин - 50:50, скорость потока элюента - 0,3 см³/мин.

Время стабилизации хроматографической системы после анализа пробы: 7 мин (общее время анализа 20 мин).

Объем вводимой пробы: 5 мм³.

Время подачи элюента во время анализа: 3 - 10 минут.

Газ-осушитель - азот с температурой 320 °C, расход 10 м³/мин.

Расход газа периферийного слоя: 11 м³/мин с температурой 400 °C.

Давление в распылителе: 30 psi.

Напряжение ионизации: 3 500 В.

Источник ионов: электроспрей.

Режим ионизации: положительный.

Режим сканирования: мониторинг множественных реакций (MRM).

Детектируемые переходы:

Флутоланил: - количественный переход, энергия соударения - 15 В; - качественный переход, энергия соударения - 25 В. Энергия фрагментации: 90 В, время сканирования: 50 мс, напряжение на ускорителе ячейки: 5 В.

M-2: - переход количественного определения, энергия соударения - 25 В; - качественный переход, энергия соударения - 20 В. Энергия фрагментации: 100 В, время сканирования: 50 мс, напряжение на ускорителе ячейки: 5 В.

M-4: - переход количественного определения, энергия соударения - 10 В; - качественный переход, энергия соударения - 15 В. Энергия фрагментации: 90 В, время сканирования: 50 мс, напряжение на ускорителе ячейки: 5 В.

M-101: - переход количественного определения, энергия соударения - 30 В, напряжение на ускорителе ячейки - 5 В; - качественный переход, энергия соударения - 10 В, напряжение на ускорителе ячейки - 7 В. Энергия фрагментации: 90 В, время сканирования: 50 мс.

Предколонка хроматографическая стальная длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Температура колонки: 40 °C.

Подвижная фаза: 0,1%-й водный раствор муравьиной кислоты - 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле в изократическом режиме 30:70 (% по объему).

Скорость потока элюента: 0,3 см³/мин.

Общее время анализа: 5 мин.

Объем вводимой пробы: 10 мм³.

Время подачи элюента во время анализа: непрерывно.

Газ-осушитель: азот с температурой 320 °C, расход 10 м³/мин.

Расход газа периферийного слоя: 11 м³/мин с температурой 400 °C.

Давление в распылителе: 30 psi.

Напряжение ионизации: 3 500 В.

Источник ионов: электроспрей.

Режим ионизации: отрицательный.

Режим сканирования: мониторинг множественных реакций (MRM).

Детектируемые переходы:

- - переход количественного определения, время сканирования 50 мс, энергия фрагментации: 80 В, энергия соударения: 10 В, напряжение на ускорителе ячейки: 7 В;

- - качественный переход, время сканирования: 50 мс, энергия фрагментации: 70 В, энергия соударения: 40 В, напряжение на ускорителе ячейки: 7 В.

Колонка хроматографическая стальная длиной 100 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 3,5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Предколонка хроматографическая стальная длиной 12,5 мм, с внутренним диаметром 2,1 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Температура колонки: 40 °C.

Подвижная фаза: 10 мМ водный раствор гидроксида аммония - 10 мМ раствор гидроксида аммония в ацетонитриле (%, по объему) в градиентном режиме. Градиент потока элюента: до 11-й мин - 50:50, скорость потока элюента - 0,2 см³/мин; с 11,5-й до 12,5-й мин - 0:100, скорость потока элюента - 0,5 см³/мин; 13-я мин - 50:50, скорость потока элюента - 0,2 см³/мин.

Время стабилизации хроматографической системы после анализа пробы: 11 мин (общее время анализа 24 мин).

Объем вводимой пробы: 10 мм³.

Время подачи элюента во время анализа: 4,5 - 7,0 мин.

Газ-осушитель: азот с температурой 320 °C, расход 10 м³/мин.

Расход газа периферийного слоя: 11 м³/мин с температурой 400 °C.

Давление в распылителе: 30 psi.

Напряжение ионизации: 3 500 В.

Источник ионов: электроспрей.

Режим ионизации: отрицательный.

Режим сканирования: мониторинг множественных реакций (MRM).

Детектируемые переходы:

- - переход количественного определения, время сканирования: 50 мс, энергия фрагментации: 80 В, энергия соударения: 10 В, напряжение на ускорителе ячейки: 7 В;

- - качественный переход, время сканирования: 50 мс, энергия фрагментации: 70 В, энергия соударения: 40 В, напряжение на ускорителе ячейки: 7 В.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартные растворы флутоланила и его метаболитов с концентрацией 0,025 мкг/см³, соответственно разбавляют.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание флутоланила или его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в пробах рассчитывают по формуле без учета полноты извлечения вещества из проб:

X - содержание флутоланила или его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_пр - высота (площадь) пика образца, мм;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³);

P - содержание флутоланила или его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в аналитических стандартах, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг <*>".

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочных характеристик осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочных характеристик проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в которых должно охватывать весь диапазон концентраций градуировочных характеристик.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

13.1.1. Градуировочная характеристика для определения флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в воде:

X - концентрация флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в ацетонитриле, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

3 (8; 3; 9; 5) - погрешность градуировочной характеристики, %.

13.1.2. Градуировочная характеристика для определения флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в почве:

X - концентрация флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в ацетонитриле, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

9 (10; 7; 6; 4) - погрешность градуировочной характеристики, %.

13.1.3. Градуировочная характеристика для определения флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в клубнях картофеля:

X - концентрация флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора флутоланила и его метаболитов M-2, M-4, M-101 и M-102 в ацетонитриле, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

8 (8; 5; 10; 7) - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает указанные значения, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флутоланила и его метаболитов, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.