"МУК 4.1.3232-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой концентрации акролеина в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.12.2014)

1. Сборник подготовлен творческим коллективом авторов в составе: д.б.н., проф. А.Г. Малышева (руководитель), к.б.н. А.А. Ермаков, В.А. Шохин (ФГБУ "Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина" Минздрава России).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Методические указания утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой.

4. Введены впервые.

Включенные в сборник 10 методических указаний по определению химических соединений в биологических средах предназначены для использования в химико-аналитических исследованиях при проведении биомониторинга состояния здоровья населения, для практического использования в рамках социально-гигиенического мониторинга на территориях с высокой антропогенной нагрузкой, а также могут быть использованы для диагностических целей в рамках осуществления государственного санитарного надзора, контроля, экспертизы, расследований. Методические указания предназначены для специалистов химико-аналитических лабораторий системы Роспотребнадзора, научно-исследовательских институтов, работающих в области экологии человека, гигиены окружающей среды и защиты прав потребителей.

Методические указания, включенные в сборник, разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92 "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов", МИ 2335-95 "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа", МИ 2336-95 "Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритм оценивания".

Все методики измерения прошли метрологическую аттестацию в соответствии с правилами ПР 50.2.002-94 "ГСИ. Порядок осуществления государственного метрологического надзора за выпуском, состоянием и применением средств измерений, аттестованными методиками выполнения измерений, эталонами и соблюдением метрологических правил и норм".

В методических указаниях, включенных в сборник, приведены методы определения 15 органических соединений и 15 тяжелых металлов и элементов в биологических средах, в том числе 9 веществ и 15 элементов - в крови, 3 вещества и 12 элементов - в моче и 5 веществ - в молоке. Определение токсичных веществ и элементов основано на использовании современных высокочувствительных методов физико-химического анализа - капиллярной газовой хроматографии и газохроматографическом анализе равновесного пара, высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.

Методические указания одобрены и рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации.

Свидетельство о метрологической аттестации N 88-16374-096-01.00076-2013 от 15.11.2013.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации акролеина в моче в диапазоне концентраций от 0,04 до 2 мг/дм³.

1.2. Методические указания по измерению массовой концентрации акролеина в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии предназначены для использования территориальными органами и службами Роспотребнадзора, лечебными и научными учреждениями, осуществляющими деятельность в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

Акролеин (акриловый альдегид, этиленальдегид, 2-пропеналь) - бесцветная, легко воспламеняющаяся слезоточивая жидкость с резким запахом. Выделяется в атмосферный воздух с отработавшими газами автотранспорта, в процессе горения органического топлива, при приготовлении пищи (жарение, копчение). Относится к опасным веществам. Гигиенический норматив в Российской Федерации не установлен.

Краткая токсикологическая характеристика. Обладает выраженным раздражающим, общетоксическим, аллергенным, мутагенным действием. Угнетает синтез ДНК и клеточное деление, ингибирует ДНК-полимеразу. Оказывает цитотоксическое действие.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значения погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышают значений, приведенных в табл. 1.

Значения показателя точности используют:

- при оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

- при оценке деятельности лабораторий на качество проведения измерений;

- при оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

Измерение массовой концентрации акролеина в моче основано на взаимодействии акролеина с 3-аминофенолом с образованием производного 7-гидроксихинолина и его анализе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе и флуориметрическом детектировании.

Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 0,8 нг.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств и материалов аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают указанным.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на эксплуатацию жидкостного хроматографа.

6.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоивших метод измерений и получивших удовлетворительные результаты оперативного контроля процедуры измерений.

При приготовлении градуировочных растворов и подготовке проб к анализу соблюдают следующие условия:

Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы:

- подготовка посуды;

- приготовление растворов;

- подготовка хроматографической колонки;

- установление градуировочной характеристики.

Используемую посуду вымыть мыльным раствором, промыть проточной водопроводной водой, многократно ополоснуть дистиллированной водой и высушить при температуре 105 °C.

9.2.1. Раствор для элюирования A. 500 см³ дистиллированной воды вносят в стакан вместимостью 600 см³, устанавливают на магнитную мешалку, помещают в раствор электроды pH-метра, небольшими порциями с помощью стеклянной пипетки вносят при перемешивании концентрированную ортофосфорную кислоту до установления pH 2,5. Срок хранения раствора 5 дней.

9.2.2. Раствор для элюирования B. 25 см³ метанола помещают в мерный цилиндр вместимостью 100 см³, доводят до метки ацетонитрилом, закрывают пришлифованной стеклянной пробкой, тщательно перемешивают. Срок хранения раствора 5 дней.

9.2.3. Элюент для хроматографии. Состав элюента задают на двух каналах насоса: смешивают раствор для элюирования A и раствор для элюирования B в соотношении (94:6)% (объемная доля).

9.2.4. Раствор 3-аминофенола, молярная концентрация 0,023 моль/дм³. В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают навеску 0,1255 г 3-аминофенола, растворяют в 40 - 45 см³ дистиллированной воды при температуре 40 - 50 °C, остужают до комнатной температуры, доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора 30 дней в холодильнике при температуре 4 - 6 °C.

9.2.5. Раствор гидроксиламина гидрохлорида, молярная концентрация 0,043 моль/дм³. В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают навеску 0,1494 г гидроксиламина гидрохлорида, растворяют в 40 - 45 см³ дистиллированной воды, доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора 30 дней в холодильнике при температуре 4 - 6 °C.

9.2.6. Раствор железа (III) сульфата, массовая концентрация 2,8 мг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают навеску 0,28 г железа (III) сульфата, девятиводного, растворяют в 50 - 60 см³ дистиллированной воды, добавляют 1 см³ серной кислоты концентрированной, доводят до метки дистиллированной водой. Срок хранения раствора не ограничен.

9.2.7. Раствор серной кислоты в дистиллированной воде, 16% (объемная доля). В термостойкий стакан вместимостью 50 см³ помещают 10 см³ дистиллированной воды и 2 см³ серной кислоты концентрированной. Осторожно перемешивают, остужают до комнатной температуры. Срок хранения раствора не ограничен.

9.2.8. Исходный раствор акролеина (раствор 1). В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают 40 - 45 см³ спирта этилового, 50 мм³ стандарта акролеина и доводят этиловым спиртом до метки. Массовая концентрация акролеина в исходном растворе - 0,84 мг/см³. Срок хранения раствора 14 дней в холодильнике при температуре 4 - 6 °C.

9.2.9. Раствор акролеина для градуировки (раствор 2). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 40 - 45 см³ спирта этилового, 1 см³ исходного раствора акролеина и доводят этиловым спиртом до метки. Массовая концентрация акролеина в разбавленном растворе составляет 0,0084 мг/см³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.2.10. Раствор 7-гидроксихинолина для идентификации продукта реакции акролеина с 3-аминофенолом. В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают навеску 0,0100 г 7-гидроксихинолина, растворяют в 5 - 6 мл раствора 0,1 н хлористоводородной кислоты, доводят до метки дистиллированной водой. Концентрация 7-гидроксихинолина в растворе составляет 100 мкг/см³. Срок хранения раствора 60 дней в холодильнике при температуре 4 - 6 °C.

Колонку устанавливают в хроматограф, подают ацетонитрил со скоростью 0,2 см³/мин в течение 0,5 часа, затем подают элюент состава: 94% (объемная доля) раствора для элюирования A, 6% (объемная доля) раствора для элюирования B со скоростью 0,2 см³/мин до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора. Проводят холостую разгонку с установлением ступеней градиента: 6 мин - 6% раствора B, 13 мин - 8% раствора B, 17 мин - 10% раствора B, 22 мин - 20% раствора B с увеличением скорости подвижной фазы до 0,5 см³/мин, 36 мин - остановка разгонки.

9.4.1. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика 7-гидроксихинолина (дериват акролеина) от массовой концентрации акролеина в моче устанавливают методом абсолютной градуировки по трем сериям растворов. Каждую серию, состоящую из пяти градуировочных растворов, готовят из растворов для градуировки N 1 и 2, приготовленных по пп. 9.2.8, 9.2.9.

9.4.2. Градуировочные растворы готовят в мерных колбах вместимостью 25 см³. Для этого в каждую колбу вносят растворы акролеина для градуировки N 1 и 2 в соответствии с табл. 2, доводят до метки мочой и перемешивают. В соответствии с п. 10.2 проводят анализ холостой пробы мочи на содержание акролеина. При наличии акролеина в холостой пробе вычитают его фоновое содержание при построении градуировочного графика.

9.4.3. Приготовленный раствор акролеина в моче в количестве 10 см³ переносят в коническую пробирку из полипропилена, центрифугируют со скоростью 2 000 об./мин в течение 10 мин, отбирают 2 см³ верхнего слоя в мерную стеклянную пробирку и проводят реакцию дериватизации, добавляя в пробирку 0,5 см³ раствора 3-аминофенола, 0,5 см³ раствора гидроксиламина гидрохлорида, 25 мм³ раствора сульфата железа (III), 50 мм³ раствора серной кислоты 16 об. %. Перемешивают содержимое пробирки и нагревают на водяной бане при 100 °C в течение 15 мин для перевода акролеина в форму производного - 7-гидроксихинолина. Смесь остужают до комнатной температуры, пропускают через пористый фильтр (размер пор 0,45 мкм), используя шприц медицинский одноразовый, фильтрат собирают в виалу и анализируют 20 мм³ экстракта в рабочем режиме хроматографа.

- колонка 4,6 x 150 мм, заполненная сорбентом C₁₈;

- элюент: 94% раствора A, 6% раствора B;

- градиент элюирования: 6 мин - 6% раствора B, 13 мин - 8% раствора B, 17 мин - 10% раствора B, 22 мин - 20% раствора B с повышением скорости элюирования с 0,2 до 0,5 см³/мин, 30 мин - остановка разгонки, время после анализа - 6 мин;

Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

где C_i - массовая концентрация акролеина в градуировочном растворе, мг/дм³;

S_i - среднее значение двух измерений площади пика акролеина в форме его производного (7-гидроксихинолина), полученное при анализе i-го градуировочного раствора, условные единицы (усл. ед.);

n - количество градуировочных смесей (n = 5).

Градуировку проводят при смене реактивов или разделительной колонки.

9.4.5. Контроль стабильности градуировочной характеристики. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация акролеина соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

где C - заданная массовая концентрация акролеина в градуировочном растворе;

C_m - результат измерения массовой концентрации акролеина в образце для градуировки.

При невыполнении условия (1) стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

Отбирают пробу мочи объемом не менее 20 см³ в стеклянную тару с плотно закрывающейся крышкой. Срок хранения проб в холодильнике 8 часов.

Выполняют два параллельных измерения массовой концентрации акролеина в образце мочи. Отобранную пробу мочи в количестве 10 см³ центрифугируют со скоростью 2 000 об./мин в течение 5 - 10 мин. Отбирают 2,0 см³ верхнего слоя и помещают в мерную стеклянную пробирку, добавляют 0,5 см³ раствора 3-аминофенола, 0,5 см³ раствора гидроксиламина гидрохлорида, 25 мм³ раствора сульфата железа (III), 50 мм³ раствора серной кислоты объемной долей 16%. Перемешивают содержимое пробирки и нагревают на водяной бане при 100 °C в течение 15 мин. Смесь остужают до комнатной температуры, пропускают через пористый фильтр (размер пор 0,45 мкм), используя шприц медицинский одноразовый, фильтрат собирают в виалу и анализируют 20 мм³ экстракта в рабочем режиме хроматографа.

Идентификацию 7-гидроксихинолина проводят путем сравнения спектров и времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и стандартном растворе.

11.1. Массовую концентрацию акролеина в моче (мг/дм³) вычисляют по формуле:

где C_i - массовая концентрация акролеина в анализируемой пробе, мг/дм³;

S_i - площадь пика 7-гидроксихинолина на хроматограмме, е.о.п.;

K - градуировочный коэффициент.

11.2. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости C₁, C₂ (параллельных определений), для которых выполняется условие:

где r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (2) получают дополнительно еще два результата измерений C₃, C₄. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений (C₁, C₂, C₃, C₄), полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

где C_max,4, C_min,4 - наибольший и наименьший из 4 полученных результатов измерений;

CR_0,95(4) - критический диапазон. Значения критического диапазона приведены в табл. 3.

Результат измерений представляют в виде , где

- средний результат измерений, мг/дм³;

- характеристика погрешности, мг/дм³ при P = 0,95, значение рассчитывают по формуле: , где - относительное значение характеристики погрешности, % (приведено в табл. 1).

Контроль качества результатов измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)-02 и РМГ 76-04.

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где - результат измерений массовой концентрации акролеина в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2);

- результат измерений массовой концентрации акролеина в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2);

C_д - массовая концентрация добавки акролеина к исходной пробе.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

где , - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации акролеина в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Образцами для контроля внутрилабораторной прецизионности являются пробы мочи (рабочие пробы).

При реализации контрольной процедуры получают два результата контрольных измерений (первичного и повторного ) массовой концентрации акролеина в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:

где C₁ и C₂ - результаты измерений массовых концентраций акролеина, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности, т.е. в одной лаборатории в разное время, разными операторами;

R_л - предел внутрилабораторной прецизионности, значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (5) процедуру повторяют. При повторном превышении предела внутрилабораторной прецизионности выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости, являются образцы мочи с внесенными в них добавками аттестованного раствора акролеина, подготовленные в соответствии с п. 9.4.2.

Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости, проводят по результатам измерений массовых концентраций акролеина из образцов мочи (специально подготовленные образцы мочи с внесенными добавками аттестованного раствора акролеина) с одинаковым содержанием акролеина.

Результаты измерений признают приемлемыми при выполнении условия:

где и - результаты измерений массовых концентраций акролеина (средние арифметические параллельных определений), полученные в условиях воспроизводимости, т.е. в разных лабораториях;

R - предел воспроизводимости, значения предела воспроизводимости приведены в табл. 3.

При выполнении условия (6) результаты измерений, полученные в двух лабораториях, являются совместимыми, и может быть рассчитано общее среднее арифметическое результатов измерений, полученных в двух лабораториях.

При невыполнении условия (6) могут быть проведены процедуры проверки приемлемости согласно разделу 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6.