"МУК 4.1.3413-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пентиопирада в плодах томата и томатном соке, в ягодах винограда и виноградном соке, в семенах и масле подсолнечника, рапса и сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 14.02.2017)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, Е.Н. Тестова, Ю.Н. Савушкин).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 14 февраля 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации МВИ N РОСС RU. 0001.310430/0259.31.03.2016 от 31.03.2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств пентиопирада в ягодах винограда и виноградном соке в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг, в плодах томата и томатном соке, в семенах и масле подсолнечника, рапса и сои в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг. Методические указания носят рекомендательный характер.

Пентиопирад

(RS)-N-[2-(1,3-диметилбутил)-3-тиенил]-1-метил-3-(трифторметил)-1H-пиразол-4 карбоксамид

Структурная формула:

Молекулярная масса: 359,4.

Эмпирическая формула: C₁₆H₂₀F₃N₃OS.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: белый, без запаха.

Давление паров: 6,43 x 10^-6 Па (25 °C).

Коэффициент распределения октанол-вода: log K_ow = 4,36 (pH 4); log K_ow = 4,62 (pH 7); log K_ow = 4,54 (pH 10).

Температура плавления: 108,7 °C.

Растворимость в воде (мг/дм³, при 20 °C): 7,53.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, 20 °C): ацетон - 557; н-гексан - 0,75; гептан - 0,74; дихлорметан - 531; ксилол - 42,7; толуол - 67,0; метанол - 402; этанол - 234,5; этилацетат - 349.

Стабилен в водных растворах при pH 3 - 10 и температуре 20 °C в низких концентрациях (менее 1 мг/дм³).

Краткая токсикологическая характеристика. Пентиопирад относится к мало опасным по острой оральной (ЛД₅₀ для крыс более 2 000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД₅₀ для крыс более 2 000 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 часа) более 5 669 мг/м³). Не раздражает кожу и слизистую оболочку глаз. Не является мутагеном.

Область применения. Пентиопирад - системный фунгицид, ингибирует процесс дыхания грибов путем связывания с митохондриальным дыхательным комплексом II, останавливает прорастание спор, ингибирует рост мицелия и обладает сильным антиспоруляционным действием.

Пентиопирад используется для борьбы с паршой и мучнистой росой на яблонях с нормой расхода 0,375 - 1,125 л/га.

Пентиопирад рекомендуется для борьбы с грибковыми заболеваниями зерновых колосовых культур - септриозом, фузариозом, сетчатой пятнистостью, листовой ржавчиной и мучнистой росой в дозах 125 - 1 000 г действующего вещества на гектар.

В России установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД - 0,13 мг/кг массы тела человека; ОДК в почве - 0,9 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,02 мг/дм³; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,8 мг/м³; ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,02 мг/м³; МДУ в сельскохозяйственной продукции (мг/кг): плодовые семечковые - 0,5.

МДУ в импортируемой продукции (мг/кг): зерно пшеницы - 0,1.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении пентиопирада с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта на колонках с окисью алюминия, на колонках с флоризилом.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-91.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия и флоризилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия и флоризилом и установление градуировочной характеристики.

7.1.1. Очистка ацетонитрила. Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетона. Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/дм³. Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды. Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

7.1.4. Очистка хлористого метилена. Хлористый метилен промывают равным объемом 5% раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 ч. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °C, отбрасывают.

7.1.5. Очистка гексана. Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Гексан перегоняют при температуре 68,7 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 68,7 °C, отбрасывают.

7.2.1.1. Приготовление 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты. В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ бидистиллированной воды, прибавляют 1,0 см³ муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки бидистиллированной водой.

7.2.1.2. Приготовление 1 М раствора гидроокиси натрия. В мерную колбу на 500 см³ переносят 20 г гидроокиси натрия, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.1.3. Приготовление 0,05 М раствора двузамещенного фосфорнокислого калия. В мерную колбу на 500 см³ переносят 5,7 г двузамещенного фосфорнокислого калия и 50 г хлористого натрия, добавляют 200 - 300 см³ бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения солей, проверяют pH полученного раствора. Если pH раствора менее 9, доводят его до указанного значения с помощью 1 М раствора гидроокиси натрия, контролируя pH. После достижения нужного значения pH объем доводят водой до метки. Раствор хранят не более 3 месяцев при комнатной температуре.

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и 0,1%-й водный раствор муравьиной кислоты.

В плоскодонную колбу объемом 1 дм³ помещают 600 см³ ацетонитрила и 350 см³ 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см³/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.3.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией пентиопирада 1,0 мг/см³. Взвешивают 50 мг пентиопирада в мерной колбе объемом 50 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.3.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией пентиопирада 10,0 мкг/см³. Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 2 хранится в холодильнике не более 3 месяцев.

7.2.3.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией пентиопирада 1,0 мкг/см³. Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 3 хранится в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.3.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией пентиопирада 0,5 мкг/см³. Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор N 4 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 4 хранится в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.3.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией пентиопирада 0,2 мкг/см³. Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 50 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор N 5 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 5 хранится в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.3.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией пентиопирада 0,1 мкг/см³. Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор N 6 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 5 хранится в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.3.7. Стандартные растворы пентиопирада с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4 и 0,2 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы. Из стандартного раствора N 2 методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4 и 0,2 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы. Стандартные растворы для внесения хранят в холодильнике не более месяца.

7.2.3.8. Стандартные растворы пентиопирада с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы растительных масел. Из стандартного раствора N 2 методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы растительных масел. Стандартные растворы для внесения хранят в холодильнике не более месяца.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации пентиопирада в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 см³ ацетонитрила.

В концентратор объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора пентиопирада в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 10 см³ ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C.

Исходный концентратор последовательно обмывают двумя порциями по 10 см³ ацетонитрила. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы объемом по 100 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие пентиопирад, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Изучение поведения пентиопирада на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г флоризила с зернением 60/100 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой флоризила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см.

Непосредственно перед использованием колонку последовательно промывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 8:2, а затем 15 см³ гексана.

Из стандартного раствора пентиопирада в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/см³, отбирают 1 см³, помещают в круглодонную колбу объемом 100 см³ и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ гексана, перемешивают и полученный раствор вносят на колонку. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Исходную колбу последовательно обмывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и 5 порциями объемом 5 см³ каждая смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие пентиопирад, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Изучение поведения пентиопирада на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии флоризила.

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 1 см³/мин 3 - 4 ч.

Отбор проб проводится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 55906-13 "Томаты свежие, реализуемые в розничной торговой сети", ГОСТ Р 32876-14 "Консервы. Соки овощные, Сок томатный. ТУ", ГОСТ 32786-14 "Виноград свежий столовый. ТУ", ГОСТ Р 52184-03 "Соки плодовые и ягодные натуральные. ТУ", ГОСТ 22391-89 "Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках", ГОСТ 1129-13 "Масло подсолнечное. ТУ", ГОСТ 31759-12 "Масло рапсовое. ТУ", ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках", ГОСТ 31760-12 "Масло соевое. ТУ", ГОСТ 32190-13 "Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб".

Пробы плодов томатов и ягод винограда хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °C в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °C.

Отобранные пробы семян подсолнечника, рапса и сои подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.

Пробы томатного и виноградного соков, а также подсолнечного, рапсового и соевого масел хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более 10 суток.

Образец измельченных плодов томатов массой 10 г или измельченных ягод винограда массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 30 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в коническую колбу объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 30 см³ ацетонитрила в тех же условиях. Ацетонитрильные экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия, перемешивают и выдерживают 10 мин при комнатной температуре.

Затем объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку (не растворившуюся соль оставляют в колбе) объемом 250 см³, оставляют до полного разделения слоев в делительной воронке. Нижний водный слой отбрасывают, а верхний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток, полученный в п. 9.1.1, растворяют в 1 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ гексана, перемешивают и полученный раствор вносят на колонку, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, элюаты отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 20 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1, вносят на колонку, элюат собирают в концентратор объемом 100 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 5 см³ (для ягод винограда - в 2 см³) смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Навеску томатного сока массой 10 г или виноградного сока массой 20 г помещают в делительную воронку объемом 250 см³, добавляют 10 см³ насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают содержимое воронки, приливают 20 см³ ацетонитрила и встряхивают содержимое воронки в течение двух минут. После разделения фаз нижний слой сливают в стакан объемом 100 см³, а ацетонитрил пропускают через безводный сульфат натрия и собирают в концентратор объемом 250 см³. Водно-солевую фазу из стакана возвращают в делительную воронку и повторяют экстракцию пентиопирада в ацетонитрил еще 2 раза, используя каждый раз по 20 см³ ацетонитрила и встряхивая смесь в течение двух минут. Объединенный ацетонитрильный экстракт выпаривают до водного остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Далее проводят очистку экстракта по схеме, указанной в п. 9.1.2.

Сухой остаток растворяют в 5 см³ (для виноградного сока - в 2 см³) смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Образец измельченных семян подсолнечника (рапса или сои) массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 30 см³ ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Ацетонитрильный экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см³ через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 30 см³ ацетонитрила, в тех же условиях. Ацетонитрильные экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток, полученный в п. 9.3.1, растворяют в 1 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ гексана и проводят очистку экстракта по схеме, указанной в п. 9.1.2.

Сухой остаток, полученный в п. 9.3.2, растворяют в 10 см³ ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, наносят на подготовленную колонку, элюат собирают в концентратор. Исходную колбу обмывают 10 см³ ацетонитрила и вносят на колонку. Элюаты объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Из пробы растительного масла отбирают в стакан навеску массой 10 г и переносят ее в делительную воронку объемом 250 см³ двумя порциями гексана объемом по 25 см³. Пентиопирад экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 см³, встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой объединяют в концентраторе объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Верхний слой (гексан) отбрасывают.

К маслянистому остатку, полученному по п. 9.4.1, добавляют 5 см³ ацетонитрила, 100 см³ 0,05 М щелочного буфера (pH 9), тщательно обмывают стенки концентратора и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Пентиопирад экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 см³, встряхивая каждый раз делительную воронку по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке хлористый метилен собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2 и 9.3.3.

Сухой остаток растворяют в 5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Хроматографическая система, включающая:

- хроматограф жидкостный с диодно-матричным детектором, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °C и стандартным автосамплером с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм³ для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая стальная длиной 150 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 3,5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Предколонка хроматографическая стальная длиной 4 мм, внутренним диаметром 4 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Температура колонки: 30 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1%-я муравьиная кислота в соотношении 600:350.

Длина волны: 240 нм.

Скорость потока элюента: 0,3 см³/мин.

Чувствительность: не менее 12 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пентиопирада с концентрацией 1,0 мкг/см³, соответственно разбавляют.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание пентиопирада рассчитывают по формуле без учета полноты извлечения вещества из проб:

X - содержание пентиопирада в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_пр - высота (площадь) пика образца, мм;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

P - содержание пентиопирада в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг". <*>

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для пентиопирада проводят при смене основного градуировочного раствора N 1 каждые шесть месяцев, при смене основных градуировочных растворов N 2, 3, 4, 5 и 6 - каждый месяц, а также в начале и окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание пентиопирада в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация пентиопирада контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора пентиопирада в смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

1,48 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 1,48%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов пентиопирада, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.