"МУК 4.1.2923-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имидаклоприда в моркови, луке, горохе, зерне и соломе риса, зерне и масле сои, ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.07.2011)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений Россельхозакадемии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 июля 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Настоящий документ устанавливает методику измерения массовых концентраций имидаклоприда в моркови, луке, зерне гороха, зерне риса и сои, ягодах и соке винограда в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, в масле сои в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг, в соломе риса в диапазоне 0,04 - 0,4 мг/кг.

Действующее вещество: имидаклоприд.

Структурная формула:

1-(6-хлор)-3-пиридилметил)-N-нитроимидазолидин-2-илиденамин (IUPAC).

1-[(6-хлор-3-пиридинил)метил]-N-нитро-2-имидазолидинимин (CA).

Брутто формула: C₉H₁₀ClN₅O₂.

Мол. масса: 255,7.

Химически чистый имидаклоприд представляет собой бесцветные кристаллы со слабым характерным запахом. Температура плавления 144 °C, давление паров 4 x 10^-7 мРа (20 °C), 9 x 10^-7 мРа (25 °C). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_ow lgP = 0,57 (21 °C). Растворимость (г/дм³) при 20 °C: в воде - 0,61; дихлорметане - 55; изопропаноле - 1,2; толуоле - 0,68; н-гексане < 0,1. Стабилен к гидролизу при pH 5 - 11.

Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс - 450 мг/кг. Острая дермальная токсичность (24 ч) для крыс LD₅₀ > 5000 мг/кг. Не ирритант для кожи и глаз (кролики). Острая ингаляционная токсичность LC₅₀ (4 ч) для крыс > 5323 мг/м³, 69 мг/м³ воздуха (аэрозоль). LC₅₀ (96 ч) для рыб - 211 (237) мг/дм³. Группа токсичности по ЕРА и ВОЗ - II. Мутагенной и тератогенной активности в стандартных тестах не обнаружено.

Область применения: имидаклоприд - системный инсектицид и инсекто-протравитель группы неоникотиноидов. Эффективно уничтожает листовую тлю, белокрылку, минеров, трипсов, колорадского жука, долгоносиков на хлопчатнике, рисе, картофеле, кукурузе, сахарной свекле, овощных культурах, цитрусовых, косточковых и семечковых плодовых в течение вегетационного периода. Может использоваться для обработки как почвы, так и надземных органов растений.

В России гигиенические нормативы для имидаклоприда в моркови, луке, зерне гороха, зерне риса, зерне и масле сои, ягодах и соке винограда не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении имидаклоприда методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его жидкостной экстракции из твердых образцов, масла сои и виноградного сока с последующей очисткой экстрактов на концентрирующих патронах, заполненных силикагелем.

Идентификация имидаклоприда проводится по времени удерживания, количественное определение методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку (Symmetry C-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 см³/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 ч.

7.2.1. Приготовление 50%-го раствора ацетона: в мерную колбу емкостью 1 л помещают 500 мл ацетона и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.2.2. Приготовление 1 М раствора NaOH: 40 г едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 см³, растворяют при перемешивании в 600 см³ дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

7.2.3. Приготовление 0,025 М раствора NaOH: 25 см³ 1 М раствора едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 см³ и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

7.2.4. Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу вместимостью 1 дм³ помещают 200 см³ ацетонитрила и доводят объем до метки водой для ВЭЖХ.

7.2.5. Приготовление элюента N 1: в колбе на 1000 см³ смешивают 600 см³ н-гексана и 400 см³ этилацетата.

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,1 мг/см³: точную навеску имидаклоприда (50 +/- 0,1) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят до метки тем же растворителем.

7.3.2. Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 недели, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения для внесения в матрицу используют ацетонитрильные растворы имидаклоприда с концентрациями 1,0 и 10,0 мкг/см³, которые готовят из основного стандартного раствора с концентрацией 0,1 мг/см³ методом последовательного разбавления ацетонитрилом.

Растворы для внесения в масло готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,1 мг/см³ методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация имидаклоприда в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации имидаклоприда в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации имидаклоприда в градуировочном растворе;

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации имидаклоприда в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( = 10% при P = 0,95).

Концентрирующий патрон Диапак-силикагель промывают 5 см³ гексана со скоростью потока не более 2 см³/мин.

Отбор проб моркови производится в соответствии с ГОСТ 1721-85 "Морковь столовая свежая, заготовляемая и поставляемая"; отбор проб лука - по ГОСТ 1723-86 "Лук репчатый свежий, заготовляемый и поставляемый" и ГОСТ 27166-86 "Лук репчатый свежий реализуемый"; отбор проб гороха - по ГОСТ 28674-90 "Горох. Требования по заготовке и поставке"; отбор проб риса - по ГОСТ 6293-90 "Требования при заготовке и поставках"; отбор проб сои - по ГОСТ 10852-86. "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб"; отбор проб винограда - по ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия".

Для длительного хранения аналитические пробы моркови, лука и ягод винограда помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят в закрытой полиэтиленовой таре. Пробы виноградного сока хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение месяца, в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

Пробы зерна риса, сои, гороха подсушивают до стандартной влажности и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы соевого масла хранят в холодильнике при 0 - 4 °C в закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев.

Навеску массой (20 +/- 0,1) г измельченных проб растительного происхождения (лук, морковь, ягоды, зерно) или (5 +/- 0,05) г соломы риса помещают в коническую колбу емкостью 100 мл и экстрагируют имидаклоприд 50 см³ 50%-го водного ацетона на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще 40 см³ 50%-го водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают на роторном испарителе при температуре 40 °C до водного остатка.

Водный остаток доводят до объема 100 см³ дистиллированной водой. Пробу помещают в делительную воронку емкостью 500 см³ и промывают 30 см³ гексана, встряхивая смесь в течение 1 - 2 мин. (верхний органический слой отбрасывают). Водную фазу экстрагируют трижды хлористым метиленом порциями по 30 см³, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая нижний органический слой. Объединенный органический экстракт промывают в делительной воронке 25 см³ 0,025 М раствора NaOH, встряхивая смесь в течение 1 - 2 мин. и собирая нижний органический слой. Полученный экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 см³ хлористого метилена. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят на патроне по п. 9.4.

Перед проведением анализа пробу сока массой (20 +/- 0,1) г доводят до объема 100 см³ дистиллированной водой. Пробу помещают в делительную воронку емкостью 500 см³ и промывают 30 см³ гексана, встряхивая смесь в течение 1 - 2 мин. (верхний органический слой отбрасывают). Водную фазу экстрагируют трижды хлористым метиленом порциями по 30 см³, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая нижний органический слой. Объединенный хлористометиленовый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 см³ хлористого метилена. После этого объединенный экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят на патроне по п. 9.4.

Навеску измельченного зерна массой (20 +/- 0,1) г помещают в коническую колбу емкостью 100 см³ и экстрагируют имидаклоприд 40 см³ ацетонитрила на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды порциями по 30 см³.

Навеску масла массой (10 +/- 0,1) г помещают в делительную воронку емкостью 250 см³ и экстрагируют имидаклоприд трижды ацетонитрилом порциями по 30 см³, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая нижний органический слой.

Объединенные экстракты семян или масла промывают гексаном в делительных воронках дважды по 25 см³, встряхивая смесь каждый раз в течение 1 - 2 мин. и собирая нижний органический слой.

После этого экстракты выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстрактов проводят на патроне по п. 9.4.

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. п. 9.1 - 9.3 экстрактов растительных материалов, количественно переносят двумя порциями смеси гексан-этилацетат (60:40, по объему) по 2 см³ каждая в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-силикагель (п. 7.5). Промывают патрон 5 см³ элюента N 1, который отбрасывают. Имидаклоприд элюируют с 10 см³ этилацетата со скоростью 2 см³/мин. Полученный раствор выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мм³ раствора вводят в жидкостный хроматограф.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка Symmetry C18 или SunFire C18 (250 x 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA). Предколонка SunFire C18 (250 x 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA) для защиты аналитической колонки. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в объемном соотношении 20:80. Скорость потока элюента: 1 см³/мин. Рабочая длина волны 268 нм. Объем вводимой пробы 20 мм³. Время удерживания имидаклоприда (12,0 +/- 0,2) мин. Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,0 мкг/см³.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание имидаклоприда X (мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика имидаклоприда на хроматограмме испытуемого образца, (AU·с);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения имидаклоприда, приведенная в табл. 2, (%).

Содержание остаточных количеств имидаклоприда в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор имидаклоприда с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг (мг/дм³);

r - значение предела повторяемости (r = 2,8 ).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг (мг/дм³);

- граница абсолютной погрешности, мг/кг (мг/дм³).

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

X', X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг (мг/дм³).

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_д) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁ и X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг (мг/дм³);

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 01.5.04.678) и внесена в Федеральный реестр (ФР.1.31.2011.10035).