"МУК 4.1.3029-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств диметоморфа в корнеплодах моркови, семенах и масле подсолнечника методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 03.07.2012)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 3 июля 2012 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 00114.27.02.12 от 27.02.2012.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций диметоморфа в корнеплодах моркови, семенах и масле подсолнечника в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/куб. дм (морковь и масло подсолнечника) и 0,02 - 0,2 мг/кг (семена подсолнечника).

Диметоморф

(E,Z)-4-[3-(4-(хлорфенил)-3-(3,4-диметоксифенил)акрилоил]морфолин (IUPAC)

Мол. масса 387,9

Область применения препарата

Диметоморф - системный фунгицид для борьбы с заболеваниями, вызываемыми оомицетами, является хорошим защитным и противоспоровым средством.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении диметоморфа с использованием капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с электронно-захватным детектором (ЭЗД) после извлечения вещества из анализируемых образцов ацетонитрилом, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с флорисилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают указанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/кв. см), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ 03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

К выполнению измерений допускают специалиста, имеющего квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе, освоившего данную методику и подтвердившего экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с флорисилом, проверка хроматографического поведения диметоморфа на ней.

7.1.1. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила - 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила - 10 г карбоната калия).

7.1.2. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3. Этилацетат

7.1.3.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%

Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 куб. см, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.3.2. Очистка растворителя

Растворитель промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.2.1. Исходный раствор диметоморфа для градуировки (концентрация 200 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,02 г диметоморфа, растворяют в 50 - 70 куб. см этилацетата, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.2.2. Раствор N 1 диметоморфа для градуировки (концентрация 20 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора диметоморфа для градуировки с концентрацией 200 мкг/куб. см (п. 7.2.1), доводят до метки гексаном, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.2.3. Рабочие растворы N 2 - 5 диметоморфа для градуировки (концентрация 0,2 - 2,0 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,5; 5,0 и 10,0 куб. см раствора N 1 диметоморфа с концентрацией 20 мкг/куб. см (п. 7.2.2), доводят до метки гексаном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией диметоморфа 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 14 дней.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость суммы площадей хроматографических пиков E- и Z-изомеров (мВ · с) от концентрации диметоморфа в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Устанавливают суммы площадей пиков изомеров действующего вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.

7.4.1. Смесь гексан-этилацетат (объемное соотношение 9:1)

В мерную колбу вместимостью 250 куб. см помещают 225 куб. см гексана и 25 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.4.2. Смесь гексан-этилацетат (объемное соотношение 7:3)

В мерную колбу вместимостью 250 куб. см помещают 175 куб. см гексана и 75 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.5.1. Исходный раствор диметоморфа для внесения (концентрация 100 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г диметоморфа, растворяют в 50 - 70 куб. см изопропанола, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.5.2. Раствор N 1 диметоморфа для внесения (концентрация 10 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора диметоморфа для внесения с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), доводят до метки изопропанолом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 4 г флорисила в 30 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают смесями гексан-этилацетат в объемном соотношении 7:3, затем - 9:1, порциями по 30 куб. см, скорость прохождения растворителя - 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора N 1 диметоморфа для внесения с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.5.2), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1 по объему), помещая на ультразвуковую баню на 40 - 60 с, и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей, порциями по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 30 куб. см смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 9:1, затем 100 куб. см смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 7:3, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 120 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:1 по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:1 по объему), анализируют содержание диметоморфа по п. 9.3.

Фракции, содержащие диметоморф, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения диметоморфа следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ: морковь - ГОСТ 1721-85 "Морковь столовая свежая, заготавливаемая и поставляемая. Технические условия"; подсолнечник - ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 22391-89 "Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках", ГОСТ 12036-85 "Семена сельскохозяйственных культур. Правила приемки и методы отбора проб"; масло - ГОСТ Р 52465-2005 "Масло подсолнечное. Технические условия", ГОСТ Р 52062-2003 "Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы моркови хранят в полиэтиленовой таре в холодильнике не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Семена подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в тканевых мешочках в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6 месяцев. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С. Перед анализом образцы семян измельчают.

Пробы масла (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в холодильнике в темноте.

9.1.1. Экстракция

Измельченные образцы моркови или семян подсолнечника массой 20 г помещают в коническую колбу на 250 - 300 куб. см, добавляют 70 куб. см ацетонитрила и помешают на аппарат для встряхивания на 30 мин.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр "красная лента". В коническую колбу с пробой вносят новую порцию ацетонитрила объемом 50 куб. см и повторно экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 20 мин., затем раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Фильтр промывают ацетонитрилом, порцией 20 куб. см.

Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в делительную воронку на 250 куб. см и подвергают очистке по п. 9.1.2.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К ацетонитрильному экстракту, полученному по п. 9.1.1 и помещенному в делительную воронку на 250 куб. см, добавляют 30 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 2 - 3 мин. После полного разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и повторяют очистку с новой порцией гексана объемом 30 куб. см.

Затем ацетонитрильный раствор переносят в колбу для упаривания на 150 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °С. Сухой остаток подвергают дополнительной очистке на колонке с флорисилом по п. 9.1.3.

9.1.3. Очистка экстракта на колонке с флорисилом

Остаток, полученный по п. 9.1.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, помещают на ультразвуковую баню на 30 с, затем добавляют 4,5 куб. см гексана, выдерживая еще 1 мин. на ультразвуковой бане. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают дважды смесью гексан-этилацетат (9:1 по объему) порциями по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 50 куб. см гексана, 30 куб. см смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 9:1, затем 100 куб. см смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 7:3, элюат отбрасывают.

Диметоморф элюируют с колонки 100 куб. см смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 1:1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, остаток растворяют в 1 куб. см (пробы моркови) и 2 куб. см (пробы семян подсолнечника) смеси гексан-этилацетат (1:1 по объему) и анализируют на содержание диметоморфа по п. 9.3.

9.2.1. Экстракция

Образец масла массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 200 - 250 куб. см, растворяют в 100 куб. см гексана, переносят в делительную воронку вместимостью 500 куб. см, добавляют 50 куб. см ацетонитрила. Воронку интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой осторожно декантируют через бумажный фильтр, помещенный в конусную воронку, в химический стакан вместимостью 250 куб. см. Экстракцию повторяют новой порцией ацетонитрила объемом 30 куб. см.

Растворы объединяют, переносят в делительную воронку на 250 куб. см и подвергают очистке в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с флорисилом по пп. 9.1.2 и 9.1.3, остаток после упаривания растворяют в 1 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:1 по объему) и анализируют на содержание диметоморфа по п. 9.3.

Газовый хроматограф, снабженный электронно-захватным детектором.

Колонка капиллярная DB-1701 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм.

Температура: детектора - 320 °С, испарителя - 300 °С.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 130 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 25°/мин. до температуры 280 °С, выдержка 16 мин.

Скорость газа 1 (азот): давление 80 кПа, 33,12 см/с, поток 1,625 куб. см/мин.

Газ 2 (азот): деление потока 1:3; сброс 6,9 куб. см/мин.

Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.

Ориентировочное время выхода диметоморфа:

Z-изомер ~ 19 мин.

E-изомер ~ 20 мин.

Линейный диапазон детектирования: 0,2 - 2,0 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 2,0 мкг/куб. см, разбавляют смесью гексан-этилацетат (1:1 по объему) не более чем в 50 раз.

Содержание диметоморфа в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где:

C - концентрация диметоморфа, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков Z- и E-изомеров, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание диметоморфа в пробе моркови и масле подсолнечника менее - 0,01 мг/кг, семян подсолнечника - 0,02 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01, 0,02 мг/кг - пределы обнаружения диметоморфа в пробах моркови, масла и семян подсолнечника соответственно.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание диметоморфа в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,2 до 2,0 мкг/куб. см.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где:

X - концентрация диметоморфа в пробе при контрольном измерении, мкг/куб. см;

C - известная концентрация градуировочного раствора диметоморфа, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/куб. см;

12 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 12%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов диметоморфа, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.3.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

где:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг.

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности, табл. 1), %.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):