"МУК 4.1.2936-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств эмамектина (эмамектина бензоата) в яблоках и яблочном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.07.2011)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 июля 2011 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 0082.20.04.11 от 25.04.2011.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации эмамектина бензоата (далее - эмамектина) в яблоках и яблочном соке в диапазоне 0,005 - 0,05 мг/кг.

Область применения:

Эмамектин - несистемный инсектицид кишечно-контактного действия для защиты томатов, виноградной лозы, капусты и других культур от широкого спектра личинок лепидоптеры.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении эмамектина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с флуоресцентным детектором после экстракции эмамектина из проб яблок и яблочного сока - ацетонитрилом, очистки аликвоты экстракта на концентрирующих патронах Oazis(R) HLB, превращения вещества во флуорогенное (N-трифторацетилированное) производное.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка ацетонитрила).

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоивших данную методику и подтвердивших экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка ацетонитрила (при необходимости), приготовление реактива для дериватизации, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов Oazis(R) HLB.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.2.1. Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с массовой долей 0,1% (0,1%-й раствор). В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 250 - 300 куб. см бидистиллированной воды, вносят 1 куб. см ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 950 куб. см ацетонитрила, вносят 50 куб. см 0,1%-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 1,3 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

Смешивают трифторуксусный ангидрид и свежеперегнанный ацетонитрил в объемном соотношении 1:2. Реактив годен в течение рабочего дня.

7.5.1. Исходный раствор эмамектина для градуировки (концентрация 200 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,0200 г эмамектина, растворяют в 50 - 60 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре -18 °C в течение 6 месяцев.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.5.2. Раствор N 1 эмамектина для градуировки и внесения (концентрация 2 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного раствора эмамектина с концентрацией 200 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре -18 °C в течение 6 месяцев.

Этот раствор используют для приготовления проб яблок и яблочного сока с внесением эмамектина при оценке полноты извлечения вещества методом "внесено-найдено", а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.5.3. Рабочие растворы N 2 - 5 эмамектина для градуировки (концентрация 0,01 - 0,1 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора N 1 с концентрацией 2 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией эмамектина 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см соответственно.

Рабочие растворы сразу после приготовления помещают в морозильную камеру, где хранят при температуре -18 °C в течение 6 месяцев.

7.5.4. Рабочие растворы N 2а - 5а флуорогенного производного эмамектина для градуировки (соответствуют концентрации эмамектина 0,01 - 0,1 мкг/куб. см). В 4 градуированные пробирки вместимостью 10 куб. см вносят по 1 куб. см каждого из 4 рабочих растворов эмамектина N 2 - 5 (п. 7.5.3), прибавляют по 0,1 куб. см 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 - 5 °C, помещая пробирки на ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 куб. см реактива для дериватизации (приготовленного по п. 7.4), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку вносят по 0,6 куб. см бидистиллированной воды и 3 куб. см ацетонитрила, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2а - 5а флуорогенного производного с концентрацией эмамектина 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см соответственно.

Рабочие растворы сразу после приготовления помещают в морозильную камеру, где хранят при температуре -18 °C в течение месяца.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (ЕЛ х с) от концентрации эмамектина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам флуорогенного производного эмамектина N 2а - 5а для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 10 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значение площадей отличается более чем на 11% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума и промывают с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом. Используют 1 куб. см метанола, затем 2 куб. см бидистиллированной воды со скоростью прохождения растворителей через патрон 1 - 2 капли в секунду. Патроны готовят непосредственно перед анализом.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами: 16270-70 "Яблоки свежие ранних сортов созревания", ТУ. 21122-75 "Яблоки свежие поздних сортов созревания. ТУ"; 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки"; 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Пробы яблок хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5 дней, яблочный сок анализируют в день приготовления.

Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом яблоки измельчают.

Образец измельченных яблок массой 10 г (m) помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют порцию ацетонитрила объемом 47 куб. см, помещают на 3 мин. в ультразвуковую баню, затем 15 мин. встряхивают на механическом встряхивателе. Пробе дают отстояться, переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 5 мин. при 3500 об./мин. Аликвоту надосадочной жидкости объемом 10 куб. см (1/5 часть экстракта) с помощью пипетки переносят в плоскодонную колбу вместимостью 50 куб. см, добавляют порцию бидистиллированной воды объемом 18 куб. см, помещают на 2 мин. в ультразвуковую баню, подвергают очистке по п. 9.2, затем дериватизации по п. 9.3.

Пробу, полученную по п. 9.1 или 9.4, вносят с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом на концентрирующий патрон Oazis HLB 3сс (60 mg), подготовленный по п. 7.7, со скоростью пропускания раствора 2 - 3 кап./с, не допуская пересыхания патрона. После нанесения пробы патрон промывают 2 куб. см смеси вода-ацетонитрил (7:3 по объему), пропуская растворитель до нижнего края сорбента, элюаты отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 2 куб. см ацетонитрила, собирая элюат непосредственно в круглодоннную колбу для упаривания вместимостью 20 - 25 куб. см (при сборе элюата в пробирку и последующем переносе раствора в колбу для упаривания пробирку необходимо обмыть дважды порциями ацетонитрила по 2 - 3 куб. см). Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха. Для полного удаления следов влаги в колбу вносят 3 - 5 куб. см ацетонитрила и вновь упаривают. Остаток в колбе растворяют в 1 куб. см ацетонитрила (V), помещая в ультразвуковую баню на 2 мин. и подвергают дериватизации по п. 9.3.

К ацетонитрильному раствору, полученному по п. 9.2, прибавляют 0,1 куб. см 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 - 5 °C, помещая пробирки с ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 куб. см реактива для дериватизации (приготовленного по п. 7.3), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре. По окончании процесса в пробирку вносят 0,6 куб. см бидистиллированной воды и 3 куб. см ацетонитрила, тщательно перемешивают и анализируют в условиях хроматографирования, указанных в п. 9.5.

Образец сока массой 10 г (m) помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 40 куб. см ацетонитрила, помещают на 5 мин. в ультразвуковую баню, затем 15 мин. встряхивают на механическом встряхивателе. Пробу переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 5 мин. при 3500 об./мин. Аликвоту надосадочной жидкости объемом 10 куб. см (1/5 часть экстракта) с помощью пипетки переносят в плоскодонную колбу вместимостью 50 куб. см, добавляют 15 куб. см бидистиллированной воды, помещают на 2 мин. в ультразвуковую баню, подвергают очистке по п. 9.2, затем дериватизации по п. 9.3.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Жидкостный хроматограф с флуоресцентным детектором с переменной длиной волны.

Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Eclipse XDB C18, зернение 5 мкм.

Температура колонки: 35 °C.

Объем вводимой пробы: 10 куб. мм.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1%-я ортофосфорная кислота (95:5 по объему).

Скорость потока элюента: 1,3 куб. см/мин.

Ориентировочное время выхода:

Образцы, дающие пики, большие чем градуировочный раствор флуорогенного производного эмамектина с концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют ацетонитрилом (не более чем в 10 раз).

Содержание эмамектина в пробе рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где U - граница расширенной неопределенности (табл. 1), %.

Если содержание эмамектина менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание эмамектина в пробе яблок и яблочного сока - менее 0,005 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> - 0,005 мг/кг - предел обнаружения в яблоках и яблочном соке.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора.