"МУК 4.1.2761-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имидаклоприда в цитрусовых, ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 16.11.2010)

1. Методические указания разработаны ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора".

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

3. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций имидаклоприда в мякоти и соке цитрусовых, ягодах и соке винограда в диапазоне 0,01 - 0,2 мг/кг.

Имидаклоприд

1-(6-хлор-3-пиридилметил)-N-нитро-2-имидазолидин-2-илиденамин (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Область применения препарата

Имидаклоприд - инсектицид нервно-паралитического действия из класса неоникотиноидов, эффективно уничтожает листовую тлю, белокрылку, минеров, трипсов, колорадского жука, долгоносиков на хлопчатнике, рисе, картофеле, кукурузе, сахарной свекле, овощных, цитрусовых, плодовых (косточковых и семечковых) культурах в течение вегетационного периода. Вещество обладает системной активностью и может использоваться для обработки почвы и надземных органов растений.

МДУ имидаклоприда (в импортируемой продукции) в винограде и цитрусовых - 1,0 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении имидаклоприда с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после извлечения вещества из анализируемых образцов ацетонитрилом, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с флорисилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоивших данную методику и подтвердивших экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление раствора гидроксида натрия, градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с флорисилом, проверка хроматографического поведения имидаклоприда на ней.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила 10 г карбоната калия).

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 куб. см, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.3.2. Очистка растворителей. Каждый растворитель промывают последовательно 5%-ным водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, содержащую 300 - 400 куб. см деионизованной воды, помещают (1 +/- 0,1) г натрия гидроксида, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 220 куб. см ацетонитрила, вносят 780 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.3) при скорости подачи растворителя 0,8 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.5.1. Исходный раствор имидаклоприда для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г имидаклоприда, растворяют в 50 - 70 куб. см ацетонитрила, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 6-ти месяцев.

Градуировочные растворы N 2 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.5.2. Раствор N 1 имидаклоприда для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора имидаклоприда с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более 3-х месяцев.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено".

7.5.3. Рабочие растворы N 2 - 6 имидаклоприда для градуировки (концентрация 0,05 - 1,0 мкг/куб. см). В 5 мерных колб вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 и 10 куб. см раствора N 1 имидаклоприда с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.3, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрацией имидаклоприда 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более месяца.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площадей пиков (мЕА x c) от концентрации имидаклоприда в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки N 2 - 6.

В инжектор хроматографа вводят 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значение площади отличается более чем на 12% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

7.7.1. Смесь гексан-этилацетат (объемное соотношение 4:6). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 40 куб. см гексана и 60 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.7.2. Смесь гексан-этилацетат (объемное соотношение 2:8). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 20 куб. см гексана и 80 куб. см этилацетата, перемешивают.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г флорисила в 30 куб. см смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают смесями гексан-этилацетат в объемном соотношении 2:8, затем 4:6, порциями по 30 куб. см, скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см раствора N 1 имидаклоприда с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.5.2), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 30 - 40 с, и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей, порциями по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 40 куб. см смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему), элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают последовательно 50 куб. см смеси гексан-этилацетат (2:8, по объему) и 50 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, анализируют содержание имидаклоприда по п. 9.3.

Фракции, содержащие имидаклоприд, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения имидаклоприда следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами: 25896-83 "Виноград свежий столовый, ТУ", 28472-90 "Виноград свежий ручной уборки для консервирования. Требования при заготовках и поставках", 4427-82 "Апельсины. ТУ", 4428-82 "Мандарины. ТУ", 4429-82 "Лимоны. ТУ", 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы винограда, цитрусовых, сока хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 7-ми дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом образцы ягод винограда и мякоти цитрусовых измельчают с помощью гомогенизатора.

9.1.1. Экстракция

Образец измельченных с помощью гомогенизатора ягод винограда или мякоти цитрусовых массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 куб. см, добавляют 100 куб. см ацетонитрила, интенсивно встряхивают (или гомогенизируют) в течение 1 мин., затем помещают на аппарат для встряхивания на 30 минут.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр "красная лента". Растительный остаток повторно экстрагируют 50 куб. см ацетонитрила при встряхивании в течение 30 мин., раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр с пришлифованной пробкой вместимостью 250 куб. см, перемешивают, 1/2 его часть, эквивалентную 10 г пробы, переносят в колбу для упаривания на 250 куб. см, добавляют 20 куб. см воды и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до объема 10 - 15 куб. см. Очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.1.2, затем на колонке с флорисилом по п. 9.1.3.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей. Водный остаток в колбе, полученный по п. 9.1.1, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, колбу дополнительно обмывают 40 куб. см воды, которую также переносят в воронку. Вносят в воронку 10 куб. см н-гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. Верхний органический слой отбрасывают. Водную фазу возвращают в делительную воронку и операцию промывки повторяют новой порцией гексана объемом 10 куб. см. Верхний гексановый слой отбрасывают. Водную фазу вновь возвращают в делительную воронку, вносят 20 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают. Затем в делительную воронку с водным раствором вносят 30 куб. см дихлорметана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в коническую колбу на 250 - 300 куб. см. Экстракцию имидаклоприда повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 30, затем 20 куб. см. Объединенный дихлорметановый экстракт вновь возвращают в делительную воронку и промывают 20 куб. см 0,025 М раствора NaOH при встряхивании в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 куб. см, фильтруя через слой безводного (около 1 см) сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в химическую воронку, упаривают досуха и дополнительно очищают на колонке с флорисилом по п. 9.1.3.

9.1.3. Очистка экстракта на колонке с флорисилом

Остаток, полученный по п. п. 9.1.2 или 9.2.1, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 3 куб. см смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды смесью гексан-этилацетат (4:6, по объему) порциями по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 40 куб. см смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 4:6, затем 50 куб. см смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 2:8, элюат отбрасывают.

Имидаклоприд элюируют с колонки 50 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 9.3.

Пробу сока массой 10 г помещают в коническую колбу на 250 - 300 куб. см, вносят 80 куб. см бидистиллированной воды. Пробу переносят в делительную воронку на 250 куб. см, ополаскивая колбу, в которой находилась проба, дополнительной порцией воды объемом 20 куб. см. Вносят в воронку 10 куб. см н-гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. Верхний органический слой отбрасывают. Водную фазу возвращают в делительную воронку и операцию промывки повторяют новой порцией гексана объемом 10 куб. см. Верхний гексановый слой отбрасывают. Водную фазу вновь возвращают в делительную воронку, вносят 20 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают. Затем в делительную воронку с водным раствором вносят 30 куб. см дихлорметана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в коническую колбу на 250 - 300 куб. см. Экстракцию имидаклоприда повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 30, затем 20 куб. см. Объединенный дихлорметановый экстракт вновь возвращают в делительную воронку и промывают 20 куб. см 0,025 М раствора NaOH при встряхивании в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 куб. см, фильтруя через слой безводного (около 1 см) сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в химическую воронку, упаривают досуха и дополнительно очищают на колонке с флорисилом по п. 9.1.3.

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны.

Рабочая длина волны: 268 нм.

Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Eclipse XDB C18, зернение 5 мкм.

Температура колонки: 24 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (22:78, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Ориентировочное время выхода имидаклоприда: 7,7 - 7,9 мин.

Линейный диапазон детектирования 1 - 20 нг.

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков вещества (в мЕА x c), находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию имидаклоприда в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики, большие чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.3, не более чем в 50 раз.

Содержание имидаклоприда в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание имидаклоприда в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора".