"МУК 4.1.2782-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств карбендазима в зерне гороха и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.11.2010)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 ноября 2010 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики N 01.5.04.673 от 25.06.2010.

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств карбендазима в зерне гороха и масле рапса в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Действующее вещество: карбендазим.

Структурная формула (не приводится).

Метилбензимидазол-2-илкарбамат (IUPAC).

Молекулярная масса: 191,2.

Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок без цвета и запаха.

Температура плавления 302 - 307 °С (с разложением).

Давление пара 0,09 мРа (20 °С); 0,15 мРа (25 °С); 1,3 мРа (50 °С).

Растворимость в воде (мг/куб. дм, 24 °С): 29 (pH 4); 8 (pH 7); 7 (pH 8).

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 24 °С): диметилформамид - 5; ацетон - 0,3; этанол - 0,3; хлороформ - 0,1; этилацетат - 0,135; дихлорметан - 0,068; бензол - 0,036; циклогексан и диэтиловый эфир - < 0,01; н-гексан - 0,0005.

Область применения: фунгицид системного действия с длительным защитным и целебным эффектом. Эффективно подавляет развитие заболеваний растений, вызываемых грибами из родов Septoria, Fusarium, Erysiphe и Pseudocercosprella на зерновых культурах; Sclerotinia, Alternaria и Cylindrosporium на семенах рапса.

В России для карбендазима установлены следующие гигиенические нормативы:

- ПДК в воде - 0,1 мг/куб. дм;

- ОДК в почве - 0,1 мг/кг;

- МДУ (мг/кг) - корнеплоды сахарной свеклы 0,1; зерно хлебных злаков 0,2.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении карбендазима методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем и очистки экстракта путем перераспределения кислотно-основных форм карбендазима между двумя несмешивающимися фазами.

Идентификация карбендазима проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку (Acquity BEH С18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. 0,05%-ный раствор трифторуксусной кислоты: 0,5 куб. см свежеперегнанной трифторуксусной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм помещают 100 куб. см ацетонитрила и доводят объем до метки 0,05%-ным раствором трифторуксусной кислоты.

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 1,0 мг/куб. см: точную навеску карбендазима (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,4; 0,8; 1,2; 2,0 и 4,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 4,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,4 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 2,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,2 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 1,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 3 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,8 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,4 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения карбендазима в зерне гороха и масле рапса используют ацетонитрильные растворы вещества.

7.4.1. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация карбендазима в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбендазима в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

Отбор проб зерна гороха проводят в соответствии с ГОСТ 28674-90 "Горох. Требования по заготовке и поставке".

Среднюю пробу зерна гороха измельчают, перемешивают и выделяют аналитические пробы. Для длительного хранения аналитические пробы зерна гороха помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.

Отбор проб семян рапса для получения масла проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

10 г измельченных семян гороха помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 5 куб. см воды и 50 куб. см этилацетата. Экстрагируют в ультразвуковой бане в течение 10 мин. Массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "красная лента" и экстракцию повторяют с 50 куб. см этилацетата. Объединенный экстракт помещают в делительную воронку и отделившийся водный слой отбрасывают. Из органического экстракта карбендазим экстрагируют 30 куб. см 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной. Водный слой отделяют. Экстракцию повторяют еще 2 раза. Объединенный водный экстракт промывают последовательно дважды по 30 куб. см гексана и дважды по 20 куб. см этилацетата <*>. Органические слои отбрасывают, а водный подщелачивают 1 М раствором гидроксида натрия до pH 10 и экстрагируют карбендазим 30 куб. см этилацетата. Экстракцию повторяют еще дважды, доводя pH водной фазы до 10 перед каждой экстракцией. Этилацетатный экстракт помещают в делительную воронку, выделившийся водный (нижний) слой отбрасывают, а органический промывают 25 куб. см воды, доведенной до pH 10 1 М раствором гидроксида натрия. Промывку отбрасывают. Органический экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1,25 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

--------------------------------

<*> Повторную экстракцию нужно проводить только после полного разделения фаз. Для ускорения процесса разделения можно в делительную воронку добавить 1 - 2 куб. см этилового спирта.

10 г масла растворяют в 90 куб. см гексана, помещают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см и экстрагируют 30 куб. см 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной. Экстракцию повторяют еще два раза. Гексан отбрасывают. Объединенный водный экстракт промывают последовательно дважды по 30 куб. см гексана и дважды по 20 куб. см этилацетата. Органические слои отбрасывают, а водный подщелачивают 1 М раствором гидроксида натрия до pH 10 и экстрагируют карбендазим 30 куб. см этилацетата. Экстракцию повторяют еще дважды, доводя pH водной фазы до 10 перед каждой экстракцией. Объединенный этилацетатный экстракт промывают 25 куб. см, доведенной до pH 10 1 М раствором гидроксида натрия. Промывку отбрасывают, а органический экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1,25 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH С18 (2,1 х 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 +/- 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,05%-ной трифторуксусной кислоты в соотношении 10:90. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 280 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

Время удерживания карбендазима (5,1 +/- 0,1) мин.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,4 - 4,0 мкг/куб. см.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание карбендазима в зерне гороха или масле рапса (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств карбендазима в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбендазима с концентрацией 4,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где:

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где ДЕЛЬТА - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,05 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения карбендазима в зерне гороха и масле рапса.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):