"МУК 4.1.3063-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания клотианидина в зеленой массе, зерне и масле кукурузы, семенах, масле и зеленой массе подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 14.07.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийский НИИ фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 14 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 14.12.2012 N 01.00225/205-78-12.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций клотианидина в зерне и масле кукурузы, семенах и масле подсолнечника в диапазоне 0,02 - 0,20 мг/кг, в зеленой массе кукурузы и подсолнечника в диапазоне 0,05 - 0,50 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: клотианидин.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (E)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил-2-нитрогуанидин.

Структурная формула:

Инсектицид нетоксичен для птиц, дафний, земляных червей, почвенных микроорганизмов и опасен для пчел при прямом контакте.

Область применения

Клотианидин - инсектицид нервно-паралитического действия, обладает широким спектром активности против сосущих, грызущих и почвенных насекомых на овощных культурах, фруктовых и цитрусовых деревьях, рисе, кукурузе, подсолнечнике и рапсе. Вещество обладает системной активностью и может использоваться как в качестве протравителя, так и для обработки почвы и надземных органов растений.

Предлагается в России в качестве составного компонента комбинированных протравителей для предпосевной обработки семян рапса и сахарной свеклы при норме расхода 5 - 10 кг д.в./т семян, а также для обработки вегетирующих растений картофеля с нормой расхода до 12,5 г д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в таблице.

Метод основан на экстракции клотианидина из зерна и зеленой массы кукурузы, семян и зеленой массы подсолнечника водным раствором ацетона, из масла кукурузы и подсолнечника водным раствором метанола, очистке экстрактов, содержащих клотианидин, от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с флоризилом, с последующим измерением содержания клотианидина в очищенных экстрактах на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектированием и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается применение других вспомогательных средств измерений и устройств аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают вышеуказанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений.

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Обучение работающих правилам безопасности труда проводят согласно ГОСТ 12.0.004-90.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, прошедший обучение, имеющий опыт работы в лаборатории и владеющий техникой проведения хроматографического анализа, освоивший данную методику и подтвердивший соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Температура колонки: 27 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (20:80, в объемных соотношениях).

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 270 нм.

Чувствительность: 0,001 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 5 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 1 нг.

Измерениям предшествуют следующие операции: приготовление растворов, подвижной фазы для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), градуировочных растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, приготовление колонки с флоризилом и установление объема и состава элюента, необходимого для полного вымывания клотианидина из колонки с флоризилом.

Срок хранения - 1 неделя.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 200 куб. см ацетонитрила, 800 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Срок хранения - 1 неделя.

Хроматографическую колонку устанавливают в термостат хроматографа и стабилизируют при температуре 27 °C и скорости потока подвижной фазой 0,8 куб. см/мин. не менее часа до установления стабильной базовой линии (дрейф базовой линии в течение 1 ч не более 5%, а уровень шумов не более 2% от верхнего значения шкалы).

8.4.1. Исходный градуировочный раствор клотианидина с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г клотианидина, растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят при температуре не выше -18 °C. Срок хранения - не более 3 месяцев.

8.4.2. Градуировочный раствор клотианидина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (раствор N 1)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора клотианидина с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 8.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения клотианидина методом "внесено - найдено" используется ацетоновый раствор вещества с концентрацией 10 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 и ацетоновый раствор клотианидина хранят при температуре не выше -18 °C. Срок хранения - не более 1 месяца.

8.4.3. Градуировочные растворы клотианидина с массовой концентрацией 0,02 - 0,2 мкг/куб. см (растворы N 2 - 5)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,2, 0,4, 1,0 и 2,0 куб. см градуировочного раствора N 1 клотианидина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см, доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.2, тщательно перемешивают. Получают растворы с массовой концентрацией клотианидина 0,02, 0,04, 0,1 и 0,2 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мкВ·с) от концентрации клотианидина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 5 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 8.4.3) и анализируют при условиях п. 7.2. Осуществляют не менее трех параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 10 мм помещают тампон из стекловаты и затем в нее всыпают 10 г сухого флоризила. Колонку промывают 30 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Через колонку пропускают 15 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего колонка готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии флоризила проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания клотианидина из колонки с флоризилом.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 клотианидина с концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле (п. 8.4.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 2 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с флоризилом, подготовленную по п. 8.7. Колбу обмывают 3 куб. см этилацетата, которые также вносят в колонку. Промывают колонку 50 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 50 куб. см смеси этилацетат-ацетонитрил с объемным соотношением компонентов 1:1, отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 2 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 8.2, перемешивают и хроматографируют в соответствии с условиями п. 7.2.

По результатам обнаружения клотианидина в каждой из фракций определяют объем смеси этилацетат-ацетонитрил с объемным соотношением 1:1, необходимый для полного вымывания клотианидина из колонки.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79) и правилами, определенными ГОСТ Р 50436-92 "Зерновые. Отбор проб зерна", ГОСТ 13634-90 "Кукуруза. Требования при заготовке и поставке", ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 11291-93 "Масло подсолнечника. Требования при заготовках и поставках", ГОСТ 27262-87 "Корма растительного происхождения. Методы отбора проб" и ГОСТ 27978-88 "Корма зеленые. Технические условия".

Пробы зерна кукурузы и семян подсолнечника высушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов. Пробы зеленой массы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C. Масло хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °C. В некоторых случаях масло получают из зерна кукурузы и семян подсолнечника экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

10.1.1. Зерно кукурузы, семена подсолнечника. Образец размолотого зерна или семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон-вода с объемным соотношением компонентов 3:1, перемешивают и колбу помещают на встряхиватель на 40 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Остаток на фильтре промывают 50 куб. см приведенной выше смеси. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть, эквивалентную 5 г образца, переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

10.1.2. Зеленая масса. Образец измельченного растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, приливают 125 куб. см смеси ацетон-вода с объемным соотношением компонентов 3:1 и гомогенизируют 3 мин. при 8000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см смеси ацетон-вода с объемным соотношением 3:1. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/5 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

10.1.3. Масло. Образец масла массой 5 г вносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, добавляют 20 куб. см гексана, перемешивают. К раствору добавляют 50 куб. см смеси метанол-вода с объемным соотношением компонентов 8:2 и воронку интенсивно встряхивают в течение двух минут. После разделения фаз декантируют водно-метанольный слой в круглодонную колбу через слой ваты, помещенной в конусную воронку. Маслянистый остаток повторно обрабатывают 50 куб. см смеси метанол-вода с объемным соотношением 8:2 и водно-метанольную фазу фильтруют через вату. Вату на фильтре промывают 10 куб. см смеси метанол-вода с объемным соотношением 8:2, фильтрат объединяют с водно-метанольными экстрактами и переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 10.2.

Отобранные аликвоты экстрактов растительного материала (пп. 10.1.1, 10.1.2), а также экстракт масла (п. 10.1.3) упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка объемом 3 - 5 куб. см при температуре не выше 40 °C. К водному остатку приливают 20 куб. см деионизованной воды, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний органический слой собирают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, а водную фазу экстрагируют еще дважды, используя по 30 куб. см хлористого метилена. К объединенной дихлорметановой фракции в делительной воронке вместимостью 250 куб. см приливают 25 куб. см водного раствора углекислого калия с молярной концентрацией 0,05 моль/куб. дм (п. 8.1), содержимое интенсивно встряхивают в течение двух минут. После разделения фаз нижний органический слой, содержащий клотианидин, фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу и затем упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 10.3.

Сухой остаток экстрактов зерна, семян, масла или зеленой массы, полученный по п. 10.2, растворяют в 3 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 8.4. Колбу обмывают 3 куб. см этилацетата, который также наносят на колонку. Колонку промывают 40 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Клотианидин элюируют из колонки 25 куб. см смеси этилацетат-ацетонитрил с объемным соотношением компонентов 1:1 непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток экстракта зерна, семян и масла растворяют в 5 куб. см, а зеленой массы в 12,5 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 8.2), раствор помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. и анализируют на содержание клотианидина по п. 11.

Полнота извлечения клотианидина при проведении всех операций подготовки пробы не менее 81%.

11.1. В инжектор хроматографа вводят 5 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (пп. 10.1 - 10.3), анализируют при условиях (п. 7.2) и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

11.2. Для каждого образца повторяют операции по пп. 10.1 - 10.3, 11.1.

12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации.

Альтернативная обработка результатов.

По градуировочной характеристике находят значение массовой концентрации клотианидина в экстрактах, C, мкг/куб. см.

Массовую долю клотианидина X, мг/кг, в образцах зерна, семян, масла и зеленой массы рассчитывают по формуле:

12.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

12.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

В случае, если полученный результат измерений ниже нижней границы диапазона измерений, то результат анализа представляют в виде:

"массовая доля клотианидина в зерне, семенах и масле менее 0,02 мг/кг";

"массовая доля клотианидина в зеленой массе менее 0,05 мг/кг".

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал клотианидина, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,2 мкг/куб. см, разбавляют, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой.

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

13.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

13.3. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Если предел воспроизводимости не превышен, то приемлемы все результаты измерений и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если предел воспроизводимости превышен, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.4).