"МУК 4.1.2993-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств клофентезина в цитрусовых методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.03.2012)

Свидетельство о метрологической аттестации от 16.08.2011 N 0096.12.08.11.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярного газохроматографического анализа для измерения массовых концентраций клофентезина в цитрусовых в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Название вещества по ИСО: клофентезин.

Название вещества по ИЮПАК: 3,6-бис(2-хлорфенил)-1,2,4,5-тетразин.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 303,1.

Красное кристаллическое вещество без запаха. . Давление паров (25 °C). Растворимость (мкг/дм3) в воде при 20 °C: 2,52 (pH 5); < 2 (pH 7); < 2 (pH 9,2). Растворимость в органических растворителях при 25 °C (г/100 см3): гексан - 0,1; ацетон - 0,93; этанол - 0,05; ксилол - 0,5; дихлорметан - 3,74; диметил сульфоксид - 1,18. Стабильность в водных растворах: при pH 6,98 и 22 °C - 34,4 ч; плотность при 20 °C: 1,51 г/см3.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность крысы, мыши > 5200 мг/кг; острая дермальная токсичность крысы > 2100 мг/кг; острая ингаляционная токсичность для крыс > 9 мг/дм3.

Рекомендуемый МДУ - 0,5 мг/кг.

Область применения

Клофентезин является акарицидом контактного действия для борьбы с клещами при применении на яблоне, винограде.

В Российскую Федерацию поступают по импорту цитрусовые культуры, выращенные при применении препаратов на основе клофентезина.

При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Измерения концентраций клофентезина выполняют методом газовой хроматографии (ГХ) с применением электронозахватного детектора (ДЭЗ) после извлечения его из исследуемой пробы органическим растворителем, очистки от коэкстрактивных веществ в системе жидкость - жидкость и последующей очистки на концентрирующем патроне Sep-Pak Classik Silika.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные средства измерений, устройства и материалы

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений и устройств иных производителей, технические характеристики которых не уступают указанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе, освоивших данную методику и подтвердивших экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

К проведению профподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов, проверка хроматографического поведения клофентезина на патроне Sep-Pak Classik Silika.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Ацетон

Ацетон перегоняют над небольшим количеством марганцовокислого калия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.1.2. Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом натрия.

7.1.3. Этилацетат

7.1.3.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.3.2. Очистка растворителя. Растворитель промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.2. Кондиционирование хроматографической колонки

Колонку капиллярную (DB-1701) кондиционируют в токе азота при температуре 210 °C, не подсоединяя к детектору в течение 8 - 10 ч.

7.3. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

7.3.1. Исходный раствор клофентезина для градуировки (концентрация 100 мкг/см3)

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,01 г аналитического стандарта клофентезина, растворяют в 50 - 60 см3 гексана, доводят гексаном до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 2 месяцев.

7.3.1.1. Рабочий раствор N 1 для градуировки (концентрация 10,0 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10,0 см3 исходного раствора для градуировки с концентрацией 100 мкг/см3 (п. 7.3.1), доводят до метки гексаном, тщательно перемешивают на ультразвуковой бане, получают рабочий раствор N 1 для градуировки с концентрацией клофентезина 10 мкг/см3. Раствор хранится в холодильнике в течение 2 недель.

7.3.1.2. Рабочие растворы N 2 - 5 для градуировки и внесения (концентрация 0,1 - 1,0 мкг/см3). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см3 исходного раствора N 1 для градуировки с концентрацией 10 мкг/см3 (п. 7.3.1.1), доводят до метки гексаном, тщательно перемешивают на ультразвуковой бане, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией клофентезина 0,1 - 1,0 мкг/см3 соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике в течение 10 дней.

Эти растворы клофентезина используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующих веществ методом "внесено - найдено".

7.4. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (S, мв x с) от концентрации клофентезина в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки N 2 - 5.

В испаритель газового хроматографа вводят по 1 мм3 каждого градуировочного раствора, приготовленного по п. 7.3.1.2, и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков действующего вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.

7.5. Подготовка концентрирующих патронов Sep-Pak Classik Silika

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума.

Концентрирующий патрон промывают с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, дважды по 2 см3 н-гексана со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в секунду. Патрон готовят непосредственно перед использованием. Нельзя допускать высыхания верхнего слоя сорбента.

7.6. Проверка хроматографического поведения клофентезина на концентрирующем патроне Sep-Pak Classik Silika

В круглодонную колбу вместимостью 50 см3 помещают 2,0 см3 градуировочного раствора N 5 с концентрацией 1 мкг/см3 (п. 7.3.1.2), растворитель упаривают досуха при температуре не выше 35 °C, остаток растворяют в 2 см3 гексана, помещая на ультразвуковую баню, и вносят с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон Sep-Pak Classik Silika (подготовленный по п. 7.5) со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в секунду. Колбу ополаскивают 2 раза по 2 см3 гексана, который также наносят на патрон. Элюат отбрасывают. После нанесения пробы вещество элюируют 2 см3 5%-го раствора этилацетата в гексане, затем 2 см3 20%-го раствора этилацетата в гексане, собирая каждый элюат в отдельные круглодонные колбы, упаривают при температуре не выше 35 °C досуха. Остаток растворяют в 2 см3 гексана, помещают на ультразвуковую баню на 45 - 60 с и анализируют содержание клофентезина в элюатах по п. 9.3.

Примечание. Проверку хроматографического поведения клофентезина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными: ГОСТ 4427-82 "Апельсины. Технические условия"; ГОСТ 4428-82 "Мандарины. Технические условия"; ГОСТ 4492-82 "Лимоны. Технические условия"; ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб"; "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79).

Отобранные пробы цитрусовых хранят в стеклянной таре в холодильнике не более 1 недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

9.1. Мякоть цитрусовых

9.1.1. Экстракция

Образец мякоти цитрусовых массой 20,0 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 400 - 500 см3, вносят 50 см3 смеси ацетон - вода (75:25, по объему), устанавливают на механический встряхиватель на 30 мин. Полученный экстракт осторожно декантируют и фильтруют через фильтр "красная лента" в круглодонную колбу для упаривания. Осадок на фильтре возвращают в колбу и повторяют экстракцию дополнительной порцией смеси ацетон - вода (75:25, по объему) объемом 50 см3. Экстракт концентрируют на вакуумном испарителе до водного остатка (около 50 см3). Очищают перераспределением в системе жидкость - жидкость по п. 9.1.2, затем на концентрирующем патроне Sep-Pak Classik Silika по п. 9.1.3.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе жидкость - жидкость

Водный остаток в колбе, полученный по п. 9.1.1, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, затем колбу ополаскивают 100 см3 воды и помещают в ту же воронку. Вносят в воронку 20 см3 насыщенного водного раствора хлористого натрия, 30 см3 гексана, интенсивно встряхивают в течение 5 мин. После полного разделения верхний органический слой фильтруют через безводный сульфат натрия в колбу для упаривания вместимостью 100 см3. Водную фракцию (нижний слой) возвращают в делительную воронку, вносят 30 см3 гексана, интенсивно встряхивают в течение 5 мин. Объединенный органический экстракт концентрируют на вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 35 °C, растворяют сухой остаток в 2 см3 гексана и дополнительно очищают на концентрирующем патроне по п. 9.1.3.

9.1.3. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Sep-Pak Classik Silika

Раствор, полученный по п. 9.1.2, вносят на концентрирующий патрон Sep-Pak Classik Silika, подготовленный по п. 7.5. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 2 - 3 капли в секунду. Элюат отбрасывают.

Ополаскивают колбу дважды по 2 см3 гексана, наносят на патрон, элюат отбрасывают. Клофентезин элюируют с патрона последовательно 2 см3 5%-го раствора этилацетата в гексане (соотношение 5:95, по объему) и 2 см3 20%-го раствора этилацетата в гексане (соотношение 20:80, по объему), собирая элюат в колбу для упаривания вместимостью 100 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха. Остаток растворяют в 2 см3 гексана и анализируют содержание клофентизина методом ГЖХ по п. 9.3.

9.2. Сок цитрусовых

Образец сока цитрусовых массой 20,0 г помещают в делительную воронку вместимостью 250 см3, после этого колбу ополаскивают 100 см3 воды и также переносят в ту же воронку. Вносят в воронку 20 см3 насыщенного водного раствора хлористого натрия, 30 см3 смеси гексан - этилацетат (в соотношении 1:1, по объему), интенсивно встряхивают в течение 5 мин. По достижении полного разделения верхний органический слой фильтруют через безводный сульфат натрия в колбу для упаривания вместимостью 100 см3. Водную фракцию (нижний слой) возвращают в делительную воронку, вносят 30 см3 смеси гексан - этилацетат (в соотношении 1:1, по объему), интенсивно встряхивают в течение 5 мин. Объединенный органический экстракт концентрируют на вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 35 °C, растворяют сухой остаток в 2 см3 гексана и дополнительно очищают на концентрирующем патроне по п. 9.1.3.

9.3. Условия хроматографирования

Хроматограф газовый "Кристалл 2000М", оснащенный электронозахватным детектором.

Колонка капиллярная DB-1701 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 100 °C, выдержка - 1 мин, нагрев колонки со скоростью 5 °C в минуту до температуры 170 °C, выдержка - 1 мин, нагрев колонки со скоростью 20 °C в минуту до температуры 250 °C.

Температура детектора: 300 °C.

Температура испарителя: 260 °C.

Скорость газа 1 (азот): давление 8,3 кПа; 25,204 см3/с, поток 3,206 см3/мин.

Газ 2 (азот): деление потока 1:4,1.

Скорость газа 1 (азот): давление 50,3 кПа, 25,773 см3/с, поток 1,229 см3/мин.

Хроматографируемый объем: 1 мм3.

Ориентировочное время удерживания клофентезина: 8,478 - 8,509 мин.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 1,0 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф не менее 2 раз. Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 1 мкг/см3, разбавляют гексаном.

Содержание клофентезина в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где C - концентрация клофентезина, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см3;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;

m - масса анализируемого образца, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

где , - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница расширенной неопределенности (табл. 1), %.

Если содержание клофентезина менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание клофентезина в пробе цитрусовых менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения в цитрусовых.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание клофентезина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см3.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация клофентезина в пробе при контрольном измерении, мкг/см3;

C - известная концентрация градуировочного раствора клофентезина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;

2,65 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 2,65%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов клофентезина, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.4.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном определяемых концентраций, табл. 1), %.

Контрольный параметр процедуры рассчитывают по формуле:

где , , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

где , - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Разработаны ФБУН "Федеральный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (Ракитский В.Н., Юдина Т.В., Ларькина М.В.).