"МУК 4.1.3130-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств аметоктрадина в воде, почве, огурцах, салате, луке-репке, моркови, томатах, клубнях и зеленой массе картофеля, винограде и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.11.2013)

1. Разработаны ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, А.С. Комарова, В.В. Человечкова); ГБОУ ДПО "Российская медицинская академия последипломного образования" Минздрава России (М.С. Орлов).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Протокол от 29 октября 2013 г. N 3).

3. Утверждены врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 12 ноября 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.129/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации аметоктрадина в воде в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/дм3, в почве, огурцах, луке-репке, моркови, томатах, клубнях и зеленой массе картофеля, винограде и виноградном соке в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, в салате в диапазоне концентраций 0,005 - 0,05 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: аметоктрадин.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 6-октил-5-этил-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-7-амин.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 275,39.

Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок бежевого цвета без запаха.

Температура плавления: 198 °C.

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода (20 °C).

Растворимость в воде (мг/дм3, 20 °C): 0,15.

Растворимость в органических растворителях (г/дм3, 20 °C): диметилсульфоксид - 10,7, метанол - 7,2, дихлорметан - 3,0, ацетон - 1,9, этилацетат - 0,8, ацетонитрил - 0,5, толуол - 0,1, н-гептан - 0,01.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность массы тела. Острая кожная токсичность массы тела. Острая ингаляционная токсичность . Раздражающее действие для кроликов: кожа - не раздражает; глаза - не раздражает.

Сенсибилизация - не обладает.

Область применения: системный высокоизбирательный фунгицид, применяется на овощах и винограде против фитофтороза, переноспороза, бремия и др.

В России для аметоктрадина гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении аметоктрадина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью, очистки перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и последующей очистки на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация аметоктрадина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

Патрон для удаления кислотных компонентов пробы (слабоосновный анионообменник с привитыми аминогруппами) промывают 2 см3 смеси N 2, затем 3 см3 смеси N 1.

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65 по объему, используя мерные цилиндры.

7.3.3. 20%-й раствор натрия хлористого: в мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 200 г натрия хлористого, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.4. 0,2 М раствор натрия гидроксида: 8,0 г натрия гидроксида помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску аметоктрадина (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в метаноле и доводят объем до метки метанолом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями аметоктрадина 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65).

7.4.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5,0 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения аметоктрадина в воде, почве, огурцах, салате, луке-репке, моркови, томатах, клубнях и зеленой массе картофеля, винограде и виноградном соке используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация аметоктрадина в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации аметоктрадина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации аметоктрадина в градуировочном растворе;

- результат контрольного измерения массовой концентрации аметоктрадина в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора аметоктрадина с концентрацией 1 мкг/см3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см3 смеси N 1 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см3 смеси N 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 3 см3 смеси N 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют аметоктрадин смесью N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы (ацетонитрил - 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты, 35:65) и анализируют по п. 9.6.

Фракции, содержащие аметоктрадин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения аметоктрадина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб". Отбор проб овощей производится в соответствии с техническими условиями по ГОСТ 1726-85 "Огурцы свежие"; ГОСТ 27166-86 "Лук репчатый свежий, заготовляемый и поставляемый"; ГОСТ 1721-85 "Морковь столовая свежая, заготовляемая и поставляемая"; ГОСТ 1725-85 "Томаты свежие"; ГОСТ 7194-81 "Картофель свежий. Правила приемки и методы определения качества". Отбор проб винограда проводится в соответствии с техническими условиями по ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый". Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы овощей и винограда хранят до анализа в герметичной полиэтиленовой упаковке в морозильной камере при -18 °C.

Пробу воды 100 см3 помещают в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см3 хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный натрий сернокислый, и собирают в круглодонную колбу вместимостью 25 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 вводят в хроматограф.

Навеску измельченной почвы 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, последовательно добавляют 5 см3 воды, 10 см3 ацетонитрила, 8 г семиводного магния сернокислого и 1 г натрия хлористого. Пробирку плотно закрывают и помещают в аппарат для встряхивания на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают аликвоту 5 см3, переносят в круглодонную колбу вместимостью 25 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке по п. 9.5.

Навеску измельченной культуры (5 г - зеленая масса картофеля, 10 г - огурцы, салат, лук-репка, морковь, томаты, виноград, клубни картофеля) помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3, добавляют 30 см3 смеси N 3 и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Водно-ацетоновый экстракт декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 см3, пропуская через бумажный фильтр быстрой фильтрации, к остатку в колбе добавляют 20 см3 смеси N 3 и повторяют экстракцию. Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка, добавляют 20 см3 20%-го водного раствора натрия хлористого, доводят объем до 100 см3 0,2 М раствором натрия гидроксида и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см3 хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции промывают в делительной воронке 20 см3 0,2 М раствора натрия гидроксида, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см3, пропуская через воронку, содержащую безводный натрий сернокислый. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.5.

Навеску 10 г сока помещают в стакан вместимостью 150 см3, добавляют 20 см3 20%-го водного раствора натрия хлористого, доводят объем до 100 см3 0,2 М раствором натрия гидроксида и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см3 хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции промывают в делительной воронке 20 см3 0,2 М раствора натрия гидроксида, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см3, пропуская через воронку, содержащую безводный натрий сернокислый. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.5.

Сухой остаток, полученный по пп. 9.2 - 9.4, растворяют в 1 см3 смеси N 1, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см3 смеси N 1 и также наносят на патрон. Патрон промывают 3 см3 смеси N 1, элюат отбрасывают. Аметоктрадин элюируют 5 см3 смеси N 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в подвижной фазе (0,5 см3 - почва; 1 см3 - огурцы, салат, лук-репка, морковь, томаты, клубни и зеленая масса картофеля, виноград и виноградный сок) и 10 мм3 вводят в хроматограф.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка для неионогенных среднеполярных соединений (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 295 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание аметоктрадина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

- площадь пика аметоктрадина на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения аметоктрадина, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств аметоктрадина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор аметоктрадина с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

при вероятности P = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,005 мг/кг*, где * - 0,005 мг/кг - предел обнаружения аметоктрадина в салате).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

, X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

, - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.