"МУК 4.1.2691-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ацетамиприда в семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.10 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

3. Введены в действие с 1 октября 2010 г.

4. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций ацетамиприда в семенах и масле рапса в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Ацетамиприд

Область применения препарата

Ацетамиприд - инсектицид системного, контактного и кишечного действия из группы неоникотиноидов, эффективно подавляет развитие тли, белокрылки, клопов, трипсов и жесткокрылых в посевах многих культур, особенно овощных и плодовых.

ВМДУ ацетамиприда в семенах и масле рапса - 0,01 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемых проб семян и масла ацетонитрилом, последовательной очистки экстрактов, перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, на колонке с силикагелем, затем окислением и вновь перераспределением между несмешивающимися фазами.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка препаративной колонки для очистки экстрактов, проверка хроматографического поведения вещества на ней.

7.1.1. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3. Хлористый метилен и этилацетат

Каждый растворитель промывают последовательно 5%-ным водным раствором углекислого натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным углекислым калием и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 200 - 300 куб. см деионизованной воды, вносят 56 куб. см концентрированной серной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 0,5 г марганцовокислого калия, доводят водой до метки, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 300 куб. см ацетонитрила, вносят 700 куб. см деионизованной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.4) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.6.1. Исходный раствор ацетамиприда для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г ацетамиприда, растворяют в 50 - 70 куб. см ацетонитрила, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Градуировочные растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.6.2. Растворы N 1 ацетамиприда для градуировки (концентрация 5 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,5 куб. см исходного раствора ацетамиприда с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.6.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более месяца.

7.6.3. Рабочие растворы N 2 - 5 ацетамиприда для градуировки (концентрация 0,05 - 0,5 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0, 2,0, 5,0 и 10 куб. см раствора N 1 ацетамиприда с концентрацией 5 мкг/куб. см (п. 7.6.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией ацетамиприда 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/куб. см, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 5-ти дней.

7.7.1. Исходный раствор (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г ацетамиприда, растворяют в 50 - 70 куб. см изопропилового спирта, доводят им же до метки, тщательно перемешивают.

7.7.2. Основной раствор ацетамиприда для внесения (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора ацетамиприда с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.7.1), доводят до метки изопропанолом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено".

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площадей пиков (мкВ x сек.) от концентрации ацетамиприда в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.1. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Устанавливают площади пиков (в мкВ x сек.) ацетамиприда.

Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значение площадей отличается более чем на 10% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 30 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают смесями гексан-этилацетат в объемном соотношении 1:9, затем 1:3, порциями по 30 куб. см, скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см раствора N 1 ацетамиприда с концентрацией 5 мкг/куб. см (п. 7.6.2), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 5 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:3, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 30 - 40 сек., и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.9. Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей, порциями по 5 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в сек. Промывают колонку 90 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:3, по объему), элюаты отбрасывают.

Затем колонку промывают 100 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:9, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, анализируют содержание ацетамиприда по п. 9.3.1.

Фракции, содержащие ацетамиприд, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения ацетамиприда следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", 10583-76 "Рапс. Требования при заготовках и поставках", 52062-2003 "Масло растительное. Правила приемки и методы отбора проб", 8988-2002 "Масло рапсовое. Технические условия", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79)".

Семена подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в тканевых мешочках в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6-ти месяцев. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Пробы масла (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в холодильнике в темноте.

Перед анализом образцы семян измельчают.

9.1.1. Экстракция

Образец измельченных семян массой 10 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 50 куб. см ацетонитрила и помещают на встряхиватель на 1 час. Полученный экстракт (надосадочная жидкость) фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через бумажный фильтр "красная лента". Осадок возвращают в коническую колбу и повторяют экстракцию дополнительной порцией ацетонитрила объемом 30 куб. см, выдерживая на встряхивателе 20 мин. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через бумажный фильтр "красная лента", осадок на фильтре промывают 10 куб. см ацетонитрила. Объединенный отфильтрованный экстракт подвергают очистке по п. 9.1.2.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Объединенный отфильтрованный экстракт, полученный по п. 9.1.1 или 9.2.1, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 30 куб. см гексана (насыщенного ацетонитрилом), интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, перенося в коническую колбу. Верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильную фазу вновь переносят в делительную воронку и повторяют операцию промывки, используя 25 куб. см гексана (насыщенного ацетонитрилом). Ацетонитрильный раствор переносят в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C и подвергают очистке на колонке с силикагелем по п. 9.1.3.

9.1.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Остаток, полученный по п. 9.1.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 5 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:3, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 1 мин. Затем раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.9. Колбу обмывают дважды смесью гексан-этилацетат (1:3, по объему) порциями по 5 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в сек. Промывают колонку 90 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:3, по объему), элюат отбрасывают.

Ацетамиприд элюируют с колонки 100 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:9, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C, подвергают очистке окислением и перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.1.4.

9.1.4. Очистка экстракта окислением и перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Остаток в колбе, полученный после упаривания по п. 9.1.3, растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, вносят в воронку 30 куб. см деионизованной воды, предварительно ополоснув ими колбу, где находилась проба, колбу дополнительно обмывают 20 куб. см воды, которую также переносят в воронку. Вносят в воронку 10 куб. см 4 N раствора серной кислоты, доводя pH до 1 - 2 (контроль по индикаторной бумаге).

Добавляют в воронку 10 куб. см 0,1%-ного водного раствора марганцовокислого калия (если раствор при перемешивании обесцвечивается, добавляют дополнительно 2 - 3 куб. см 0,1%-ного водного раствора марганцовокислого калия), встряхивают 1 мин. Затем в делительную воронку с водным раствором вносят 15 куб. см дихлорметана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, после полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 куб. см, фильтруя через слой безводного сульфата натрия (толщиной около 1 см), помещенный на бумажном фильтре в химической воронке. Экстракцию ацетамиприда повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 15, затем 10 куб. см. Для полного разделения фаз содержимое воронки должно отстояться 10 - 15 мин. Следы дихлорметана в водной фазе недопустимы, поскольку это снижает полноту извлечения вещества.

Объединенный дихлорметановый экстракт, пропущенный через слой сульфата натрия, упаривают, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы, анализируют содержание ацетамиприда по п. 9.3.1.

9.2.1. Экстракция

Образец масла массой 10 г помещают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, растворяют его в 50 куб. см гексана, вносят 30 куб. см ацетонитрила (насыщенного гексаном) и интенсивно встряхивают в течение 5 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой осторожно декантируют через бумажный фильтр, помещенный в конусную воронку, в коническую колбу вместимостью 250 куб. см. Экстракцию повторяют дважды дополнительными порциями ацетонитрила (насыщенного гексаном) объемом 20 куб. см. Объединенный отфильтрованный экстракт подвергают очистке по п. 9.1.2, 9.1.3, затем 9.1.4.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны.

Рабочая длина волны: 248 нм.

Хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Zorbax SB C8, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (30:70, по объему).

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Ориентировочное время выхода ацетамиприда: 8,4 - 8,7 мин.

Линейный диапазон детектирования 1 - 10 нг.

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков (в мкВ x сек.) вещества, находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию ацетамиприда в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4, не более чем в 50 раз.

Содержание ацетамиприда в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где:

C - концентрация ацетамиприда, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание ацетамиприда в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора.