"МУК 4.1.2665-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имазамокса в семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены имени Ф.Ф. Эрисмана.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 02.08.2010.

4. Вводятся в действие с 1 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций имазамокса в семенах и масле рапса в диапазоне 0,1 - 1,0 мг/кг.

Имазамокс

(RS)-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-метоксиметилникотиновая кислота (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Область применения препарата:

Имазамокс рекомендуется в качестве гербицида для борьбы с однолетними двудольными и злаковыми сорняками в посевах подсолнечника сои, рапса (опрыскивание в период вегетации).

Рекомендуемый МДУ имазамокса в семенах и масле рапса - 0,1 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемых проб семян смесью метанол - соляная кислота, масла - ацетонитрил - вода - уксусная кислота, последовательной очистки экстракта семян окислением, перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, затем на патронах Sep Pak Silica, масла - 2-стадийной очистки на концентрирующих патронах С18 Sep Pak.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии имазапира и метазахлора.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, подвижных фаз для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов Sep Pak Silica и С18 Sep Pak.

7.1.1. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3. Хлористый метилен и этилацетат

Каждый растворитель промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

Для приготовления 1 N раствора в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, содержащую 300 - 400 куб. см деионизованной воды, помещают 83 куб. см концентрированной соляной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

Для приготовления 0,05; 0,025 и 0,01 N растворов в мерные колбы вместимостью 1000 куб. см помещают соответственно 50, 25 и 10 куб. см 1 N раствора соляной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 200 - 300 куб. см деионизованной воды, вносят 56 куб. см концентрированной серной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 600 куб. см метанола, вносят 400 куб. см 0,025 N раствора соляной кислоты, перемешивают.

В колбу вместимостью 1000 - 2000 куб. см помещают 500 куб. см ацетонитрила, вносят 500 куб. см деионизованной воды и 20 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 3,85 г уксуснокислого аммония, доводят водой до метки, вносят 1 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 25 куб. см метанола, доводят до метки 0,05 М раствором уксуснокислого аммония, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 2 куб. см ледяной уксусной кислоты, доводят до метки этилацетатом, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 0,5 г марганцовокислого калия, доводят водой до метки, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 300 - 400 куб. см деионизованной воды, вносят 1 куб. см орто-фосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума <*>.

--------------------------------

<*> В отсутствие специального аллонжа жидкость продавливают через патрон с помощью поршня медицинского шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 1 - 2 капли в сек.

Концентрирующие патроны промывают с помощью медицинского шприца (или разряжения, создаваемого водоструйным насосом) последовательно метанолом, этилацетатом, хлористым метиленом порциями по 5 куб. см со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в сек. Патроны готовят непосредственно перед использованием. Нельзя допускать высыхания верхнего слоя сорбента.

7.12.1. Первая ступень очистки. Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, 5 куб. см метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в сек., затем 5 куб. см 0,01 N раствора соляной кислоты.

7.12.2. Вторая ступень очистки. Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, последовательно гексаном, хлористым метиленом, метанолом, водой, 0,05 N раствором соляной кислоты порциями по 3 куб. см.

Патроны готовят непосредственно перед использованием.

7.13.1. Измерение по п. 9.3.1.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 200 куб. см ацетонитрила, вносят 800 куб. см 0,1%-ного раствора орто-фосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

7.13.2. Измерение по п. 9.3.2.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 180 куб. см ацетонитрила, вносят 820 куб. см деионизованной воды, 1 куб. см орто-фосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.13.1 или 7.13.2) при скорости подачи растворителя соответственно 0,8 или 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.15.1. Исходный раствор имазамокса для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г имазамокса, растворяют в 50 - 70 куб. см метанола, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Градуировочные растворы N 2 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.15.2. Растворы N 1 имазамокса для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1,0 куб. см исходного раствора имазамокса с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.15.1), доводят до метки метанолом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более месяца.

7.15.3. Рабочие растворы N 2 - 5 имазамокса для градуировки (концентрация 0,1 - 1,0 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10 куб. см раствора N 1 имазамокса с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.15.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.13.1 или 7.13.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией имазамокса 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 5-ти дней.

7.16.1. Исходный раствор (концентрация 100 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г имазамокса, растворяют в 50 - 70 куб. см изопропилового спирта, доводят им же до метки, тщательно перемешивают.

7.16.2. Основной раствор имазамокса для внесения (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора имазамокса с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.16.1), доводят до метки изопропанолом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено".

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площадей пиков (mAU х сек.) от концентрации имазамокса в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.1 или 9.3.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значение площади отличается более чем на 10% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", 10583-76 "Рапс. Требования при заготовках и поставках", 52062-2003 "Масло растительное. Правила приемки и методы отбора проб", 8988-2002 "Масло рапсовое. Технические условия", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79).

Семена подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в тканевых мешочках в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6-ти месяцев. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Пробы масла (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в холодильнике в темноте.

Перед анализом образцы семян измельчают.

9.1.1. Экстракция

Образец измельченных семян массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 400 куб. см на шлифе, добавляют 200 куб. см смеси для экстракции (метанол - 0,025 N раствор соляной кислоты, 60:40, по объему), приготовленной по п. 7.4, интенсивно перемешивают в течение 5 мин.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр "красная лента", осадок на фильтре промывают 25 куб. см метанола. Отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см с пришлифованной пробкой, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/5 его часть, эквивалентную 4 г семян (около 40 куб. см), переносят в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до объема 8 - 10 куб. см. Очищают окислением, перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.1.2, затем на концентрирующих патронах Sep Pak Silica по п. 9.1.3.

9.1.2. Очистка экстракта окислением и перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Остаток в колбе, полученный по п. 9.1.1, с помощью 30 куб. см деионизованной воды переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, колбу дополнительно обмывают 20 куб. см воды, которую также переносят в воронку. Вносят в воронку 10 куб. см 4 N серной кислоты, доводя рН до 1 - 2 (контроль по индикаторной бумаге).

Добавляют в воронку 15 куб. см 0,1%-ного водного раствора марганцовокислого калия, встряхивают 1 мин. Затем в делительную воронку с водным раствором вносят 15 куб. см дихлорметана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 куб. см, фильтруя через слой безводного (около 1 см) сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в химическую воронку. Экстракцию имазамокса повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 15, затем 10 куб. см. Для полного разделения фаз содержимое воронки должно отстояться 10 - 15 мин. Следы дихлорметана в водной фазе недопустимы, поскольку это снижает полноту извлечения вещества.

Объединенный дихлорметановый экстракт, пропущенный через слой сульфата натрия, упаривают до объема 10 - 15 куб. см и дополнительно очищают на концентрирующем патроне Sep Pak Silica по п. 9.1.3.

9.1.3. Очистка экстракта семян рапса на концентрирующих патронах Sep Pak Silica

Полученный по п. 9.1.2 раствор вносят с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон Sep Pak Silica (подготовленный по п. 7.11) со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в сек. Колбу ополаскивают 2 куб. см хлористого метилена, который также наносят на патрон. После нанесения пробы патрон промывают 5 куб. см смеси хлористый метилен - этилацетат (1:1, по объему), затем 5 куб. см этилацетата, элюат отбрасывают. Вещества элюируют с патрона 15 куб. см 2%-ного раствора уксусной кислоты в этилацетате, собирая элюат в круглодонную колбу, упаривают при температуре не выше 40 °С досуха. Остаток растворяют в 4 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.13.1 или 7.13.2, и анализируют содержание имазамокса по п. 9.3.1 или 9.3.2.

9.2.1. Экстракция

Образец масла массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 200 - 250 куб. см, растворяют в 100 куб. см гексана, переносят в делительную воронку вместимостью 500 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси для экстракции (смесь ацетонитрил - вода, 1:1, с добавлением 2% ледяной уксусной кислоты), приготовленной по п. 7.5. Воронку интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой осторожно декантируют через бумажный фильтр, помещенный в конусную воронку, в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см с пришлифованной пробкой, доливают водой до 200 куб. см. Раствор перемешивают и помещают в холодильник (4 - 6 °С) на 20 - 30 мин. (раствор при этом мутнеет). Измеряют объем раствора, 1/5 его часть, эквивалентную 4 г масла (около 40 куб. см), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до объема 8 - 10 куб. см. Очищают на концентрирующих патронах С18 Sep Pak по п. 9.2.2.

9.2.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах С18 Sep Pak

Раствор в колбе, полученный по п. 9.2.1, вносят с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон С18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.12.1, со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в сек. После нанесения пробы патрон промывают 5 куб. см 0,01 N раствора соляной кислоты, элюат отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 9 куб. см 25%-ного раствора метанола в 0,05 М растворе уксуснокислого аммония (приготовленного по п. 7.7), собирая элюат в круглодонную колбу, упаривают его при температуре не выше 40 °С до объема около 3 куб. см.

Полученный раствор вносят с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон С18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.12.2. Колбу ополаскивают дважды по 1 куб. см деионизованной воды, растворы также вносят на патрон. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1 - 2 капли в сек.

Промывают патрон 3 куб. см деионизованной воды, затем 3 куб. см гексана. Гексан продавливают до нижнего края сорбента. Элюаты отбрасывают. Имазамокс элюируют с патрона 15 куб. см хлористого метилена, собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 4 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (приготовленной по п. 7.13.1 или 7.13.2), центрифугируют (фильтруют через слой стекловаты, помещенный в конусную химическую воронку) и анализируют содержание имазамокса по п. 9.3.1 или 9.3.2.

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Рабочая длина волны: 240 нм и 254 нм <*>.

--------------------------------

<*> Хроматографирование пробы при 2-х длинах волн увеличивает надежность идентификации вещества.

9.3.1. Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Eclipse XDB С18, зернение 5 мкм

Температура колонки: 25 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1%-ная орто-фосфорная кислота (20:80, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Ориентировочное время выхода имазамокса: 7,0 - 7,2 мин.

9.3.2. Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Zorbax SB С8 зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода - орто-фосфорная кислота (18:72:0,1, по объему).

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Ориентировочное время выхода имазамокса: 14,4 - 14,8 мин.

Линейный диапазон детектирования 2 - 20 нг.

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков вещества (в mAU х сек.), находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию имазамокса в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.13.1 или 7.13.2, не более чем в 50 раз.

Содержание имазамокса в пробе (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:

С - концентрация имазамокса, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г.

К = 5 с учетом объема экстракта, взятого для анализа.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание имазамокса в пробе менее 0,1 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,1 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора.