"МУК 4.1.2694-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовых концентраций 2,3-дидегидро-3-деокситимидина (ставудин) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

1. Методические указания подготовлены коллективом авторов Научно-исследовательского института медицины труда РАМН.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10 июня 2010 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

4. Введены в действие с 1 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод количественного химического анализа воздуха рабочей зоны для определения в нем ставудина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в диапазоне массовых концентраций 0,001 до 0,008 мг/куб. м. Погрешность измерений соответствует характеристикам, приведенным в табл. 1.

Методика аттестована в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 (с изменениями N 1, 2), ГОСТ Р ИСО 5725-2002. Свидетельство о государственной метрологической аттестации выдано ФГУП Всероссийским научно-исследовательским институтом метрологической службы Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии (N 3 - 10).

2.1. Структурная формула (не приводится).

2.3. Молекулярная масса: 224,2.

2.4. Регистрационный номер CAS: 3056-17-5.

2.5. Физико-химические свойства

Ставудин - белый кристаллический порошок, без запаха, с температурой плавления от 167 до 174 °C. Легко растворим в воде (83 мг/куб. см), диметилацетамиде, диметилсульфоксиде, умеренно растворим в метаноле, этаноле и ацетонитриле, мало растворим в дихлорметане, практически нерастворим в гексане.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.6. Токсикологическая характеристика

Ставудин - противоретровирусный препарат, ингибитор обратной транскриптазы вируса иммунодефицита, умеренно опасное вещество при введении в желудок, практически нетоксичен при введении в брюшную полость, оказывает слабое местное раздражающее действие на кожу, обладает слабой кожно-резорбтивной и функциональной кумулятивной активностью. Ставудин обладает широким спектром побочных и отдаленных эффектов.

Контроль ставудина в воздухе рабочей зоны на уровне чувствительности не менее 0,001 мг/куб. м, 1 класс опасности, с пометкой "++".

При соблюдении всех регламентных условий и проведении анализа в точном соответствии с прописью методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций ставудина с метрологическими характеристиками, не превышающими значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности P = 0,95).

Измерение массовых концентраций ставудина выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием.

Измерение проводят при длине волны 254 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр АФА-ХА-20.

Нижний предел измерения содержания ставудина в анализируемом объеме раствора пробы - 0,001 мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации ставудина в воздухе - 0,001 мг/куб. м (при отборе 1000 куб. дм воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления препаративных форм на основе ставудина. Измерению не мешают сопутствующие вспомогательные вещества: лактоза, целлюлоза микрокристаллическая, крахмал, магния стеарат.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы, растворы.

Допускается применение других средств измерения, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими, метрологическими характеристиками и квалификацией не хуже приведенных в данном разделе.

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004-90.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой хроматографического анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при проведении процедур контроля погрешности анализа.

8.1. Процессы приготовления растворов и подготовку проб к анализу проводят в стандартных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении 84 - 106 кПа и относительной влажности воздуха не более 80%.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

Стеклянную посуду ополаскивают ацетоном для удаления органических примесей, несколько раз промывают водопроводной водой, заливают хромовой смесью и выдерживают один час. После этого посуду извлекают из хромовой смеси, ополаскивают несколько раз водопроводной, а затем дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу. Чистую посуду для анализа хранят в закрытом виде.

9.2.1. Основной стандартный раствор ставудина с массовой концентрацией 1000 мкг/куб. см готовят растворением (0,0250 +/- 0,0001) г ставудина в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 25 куб. см. Раствор устойчив в течение недели.

9.2.2. Рабочий стандартный раствор ставудина N 1 с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см готовят разбавлением 2,5 куб. см основного стандартного раствора ставудина дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 25 куб. см. Раствор устойчив в течение недели.

9.2.3. Рабочие стандартные растворы N 2, 3, 4, 5, 6 и 7 с массовой концентрацией ставудина 10,0; 15,0; 25,0; 40,0; 50,0 и 80,0 мкг/куб. см готовят разбавлением соответственно 2,5; 3,75; 6,25; 10; 12,5; 20 куб. см рабочего стандартного раствора ставудина N 1 с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см дистиллированной водой в мерных колбах вместимостью 25 куб. см.

Растворы устойчивы в течение недели.

9.2.4. Приготовление элюента:

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см вносят 0,47 куб. см 85%-ного раствора о-фосфорной кислоты, доводят до метки дистиллированной водой и получают 0,068%-ный раствор о-фосфорной кислоты (pH = 2,5) (pH устанавливается с помощью иономера).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 5,0 куб. см ацетонитрила и 95 куб. см полученного 0,068%-ного раствора о-фосфорной кислоты. Раствор дегазируют и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 - 0,45 мкм.

Элюент хранят в герметичной стеклянной посуде в холодильнике в течение месяца.

Подготовку жидкостного хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания ставудина в хроматографируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной калибровки по шести сериям растворов из пяти параллельных измерений согласно таблице 2 следующим образом: на фильтры АФА-ХА-20, помещенные в стаканчики, наносят по 0,1 куб. см каждого рабочего стандартного раствора (N 2, 3, 4, 5, 6 и 7) с массовой концентрацией 10,0; 15,0; 25,0; 40,0; 50,0 и 80,0 мкг/куб. см, что соответствует 1,0 мкг, 1,5 мкг, 2,5 мкг, 4,0 мкг, 5,0 мкг и 8,0 мкг. После чего фильтры подсушивают при комнатной температуре, затем заливают 5,0 куб. см дистиллированной воды и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтр отжимают, раствор сливают в пробирку, а фильтр повторно заливают 5,0 куб. см дистиллированной воды и оставляют на 15 мин., периодически помешивая стеклянной палочкой. Затем фильтр отжимают, раствор сливают в ту же пробирку, объем доводят до 10,0 куб. см дистиллированной водой.

Градуировочные растворы устойчивы в течение трех суток.

Инжектируют в хроматограф по 0,01 куб. см каждого из градуировочных растворов.

По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика (приборные единицы) от содержания ставудина в хроматографируемом объеме (мкг).

Состав элюента:

5%-ный раствор ацетонитрила в водном растворе о-фосфорной кислоты (pH = 2,5)

За время удерживания ставудина принимается время удерживания пика стандарта ставудина, полученного при анализе стандартного раствора, с погрешностью +/- 5%.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце измерений и анализируют в точном соответствии с прописью методики.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

где +/- дельта - границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное измерение этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировочной характеристики, предусмотренной методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики прибор градуируют заново.

Отбор проб следует проводить с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и Руководства Р 2.2.2006-05 (прилож. 9) "Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", раздел 2 "Контроль соответствия максимальным ПДК".

Воздух с объемным расходом 80 куб. дм /мин. аспирируют через два параллельных канала аспирационного устройства, через фильтр АФА-ХА-20, помещенный в фильтродержатель. В патрон за фильтром устанавливают сетку. Для определения ставудина на уровне 0,001 мг/куб. м отбирают через каждый канал 1000 куб. дм воздуха. Отобранные пробы можно хранить в бюксах в течение недели.

Фильтр с отобранной пробой помещают в химический бюкс и экстрагируют 5,0 куб. см дистиллированной воды, помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 5 - 7 мин., затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в пробирку, а фильтр повторно экстрагируют 5,0 куб. см дистиллированной воды, снова тщательно отжимают и удаляют. Полученные растворы последовательно фильтруют с использованием химической воронки через бумажный обеззоленный фильтр "белая лента", объем доводят до 10,0 куб. см дистиллированной водой. Для анализа отбирают 0,010 куб. мм полученного раствора. Хроматографический анализ выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Количественное определение содержания ставудина (в мкг) в анализируемом объеме раствора пробы проводят по предварительно построенной градуировочной характеристике.

Примечание: фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в дистиллированной воде вспомогательных веществ, входящих в состав препаративных форм ставудина.

Массовую концентрацию ставудина в воздухе рабочей зоны C, мг/куб. м, вычисляют по формуле:

где:

а - содержание вещества в анализируемом объеме раствора пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

В - общий объем раствора пробы, куб. см;

б - хроматографируемый объем раствора пробы, куб. см;

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

Результат количественного химического анализа представляют в виде:

+/- дельта - границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация ставудина менее 0,001 мг/куб. м (более 0,008 мг/куб. м)".

13.1. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.4).

13.2. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории.

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

Для проведения серии анализов из шести проб требуется 3 часа 30 минут (без учета времени отбора пробы).

Методические указания разработаны ОАО "Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ ("ВНЦ БАВ").

Приведение объема воздуха к стандартным условиям при температуре 293 K (20 °C) и атмосферном давлении 101,33 кПа (760 мм рт. ст.):

Атропина сульфат

Бродифакум

Бромадиолон

Гексаметилентетрамин

Диоксид циркония

Пиретрум

Ритонавир

Ставудин

Уротропин

ЭП

Этилпрокситол