"МУК 4.1.1640-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Спектрофотометрическое измерение массовых концентраций фитолиазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Минздравом России 29.06.2003)

1. Методические указания подготовлены творческим коллективом специалистов Научно-исследовательского института медицины труда РАМН (Л.Г. Макеева - руководитель, Г.В. Муравьева, Е.М. Малинина, Е.Н. Грицун, Г.Ф. Громова) при участии А. И. Кучеренко (Департамент Госсанэпиднадзора Минздрава России).

2. Рекомендованы к утверждению на совместном заседании группы Главного эксперта Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию по проблеме "Лабораторно-инструментальное дело и метрологическое обеспечение" и методбюро п/секции "Промышленно-санитарная химия" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены труда и профпатологии".

3. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Министерстве здравоохранения Российской Федерации.

4. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 29.06.03.

5. Введены впервые.

Методические указания "Измерение концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны" (выпуск 42) разработаны с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций вредных веществ их предельно допустимым концентрациям (ПДК) и ориентировочным безопасным уровням воздействия (ОБУВ) и являются обязательными при осуществлении санитарного контроля.

Включенные в данный сборник 29 методик контроля вредных веществ в воздухе рабочей зоны разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 ССБТ "Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования", ГОСТ Р 8.563-96 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений", МИ 2335-95 "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа", МИ 2336-95 "Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритмы оценивания".

Методики выполнены с использованием современных методов исследования, метрологически аттестованы и дают возможность контролировать концентрации химических веществ на уровне и ниже их ПДК и ОБУВ в воздухе рабочей зоны, установленных в гигиенических нормативах - ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны", ГН 2.2.5.1314-03 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны" и дополнениях N 1 к ним.

Методические указания по измерению массовых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий промышленных предприятий при осуществлении контроля за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны, а также научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств.

Настоящие Методические указания устанавливают количественный спектрофотометрический анализ воздуха рабочей зоны на содержание фитолиазы в диапазоне концентраций 1,0 - 6,0 мг/куб. м.

2.1. Физико-химические свойства.

Фитолиаза относится к пектин-лиазам. Данная фитолиаза получена из Bacillus macerans.

Фитолиаза представляет собой сыпучий однородный порошок серого цвета со специфическим запахом. Массовая доля влаги не более 10%; рабочая зона действия фитолиазы 35 - 45 °С, рН 5,5 - 8,5. Хорошо растворима в воде.

Пектин-лиазная активность фитолиазы составляет 500 ЕД/мг.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.2. Токсикологическая характеристика.

Фитолиаза относится к малоопасным ферментным препаратам. Фитолиаза не обладает аллергенными свойствами и не раздражает слизистую оболочку глаза.

Ориентировочный безопасный уровень воздействия (ОБУВ) фитолиазы в воздухе рабочей зоны 2,0 мг/куб. м.

Методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций фитолиазы с погрешностью, не превышающей +/- 23%, при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на способности фитолиазы проявлять пектин-лиазную активность.

Пектин-лиазная активность (ПлА) характеризует способность фитолиазы катализировать расщепление альфа-1,4-связей низкометоксилированного пектина с образованием продуктов реакции с ненасыщенными связями между 4 и 5 атомами углерода в молекуле галактуроновой кислоты.

Измерение массовой концентрации фитолиазы выполняется методом фотометрии.

Метод основан на определении концентрации ненасыщенных продуктов распада пектина, имеющих максимальную оптическую плотность при длине волны 235 нм.

За единицу активности (ЕД) принята такая масса фитолиазы, которая за 1 ч при 40 °С (в условиях данной методики) вызывает образование ненасыщенных продуктов реакции, увеличивающих оптическую плотность реакционной смеси на 0,1D.

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения содержания фитолиазы в анализируемой пробе (2,0 куб. см) - 80 мкг.

Нижний предел измерения концентрации фитолиазы в воздухе при отборе 400 куб. дм - 1,0 мг/куб. м.

Определению не мешает наличие в воздухе ксиланазы, глюканазы, альфа-амилазы.

Примечание. Допускается применение иных средств измерения, вспомогательных устройств, реактивов и материалов, обеспечивающих показатели точности, установленные для данной методики выполнения измерений (МВИ).

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.

6.3. При выполнении измерений с использованием спектрофотометра или фотоэлектроколориметра соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. При выполнении измерений с использованием фотоэлектроколориметра соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

Работа на фотоэлектроколориметре должна проводиться в чистом помещении, свободном от пыли, паров кислот и щелочей. Вблизи фотоэлектроколориметра не должны располагаться громоздкие изделия, создающие неудобства в работе оператора.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим и средним специальным образованием, имеющие навыки работы на спектрофотометре.

8.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 84 - 106 кПа и влажности воздуха не более 80%.

8.2. Измерения на спектрофотометре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1.1. Приготовление стандартного раствора фитолиазы, 1 мг/куб. см

В стаканчик вместимостью 50 куб. см наливают 15 - 18 куб. см дистиллированной воды и ставят его на магнитную мешалку. Затем в него аккуратно вносят 0,05 г фитолиазы и перемешивают в течение 30 мин. Затем раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают и центрифугируют при 7000 об./мин. в течение 10 мин. Раствор готовят в день проведения анализа.

9.1.2. Приготовление раствора пектина, массовая доля 0,8%

Навеску пектина 1,00 г осторожно, во избежании комкования, переносят в колбу, содержащую 60 куб. см дистиллированной воды и 5 - 6 куб. см раствора трис-(оксиметил)-аминометана, при перемешивании на магнитной мешалке.

Если содержание пектина в реактиве не соответствует 80%, проводят пересчет навески.

Полученный раствор при комнатной температуре перемешивают на магнитной мешалке при 200 - 250 об./мин. в течение 1 ч. Затем раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и корректируют рН до значения 8,4 раствором трис-(оксиметил)-аминометана. Если рН раствора пектина превышает значение 8,4, корректировку проводят раствором соляной кислоты (0,1 моль/куб. дм). После этого объем раствора доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр (4 слоя марли и 1 слой ваты).

Раствор пектина хранят в холодильнике при 4 °С не более 2 суток.

9.1.3. Приготовление раствора хлористого кальция, 0,01 моль/куб. дм

Навеску хлористого кальция 0,11 г количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят общий объем до метки дистиллированной водой.

Раствор хранят в холодильнике не более 10 суток.

9.1.4. Приготовление раствора трис-(оксиметил)-аминометана, 0,2 моль/куб. дм

Навеску трис-(оксиметил)-аминометана 24,23 г количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см и доводят общий объем дистиллированной водой до метки.

Раствор хранят в холодильнике не более 10 суток.

9.1.5. Приготовление раствора соляной кислоты, 0,1 моль/куб. дм

В мерную колбу объемом 100 куб. см наливают примерно 70 куб. см дистиллированной воды и добавляют 0,89 куб. см соляной кислоты. Доводят до метки дистиллированной водой.

Раствор хранят при комнатной температуре до 3-х месяцев.

9.1.6. Приготовление буферного раствора трис-солянокислого, рН 8,4

Смешивают 25 куб. см раствора трис-(оксиметил)-аминометана с 18 куб. см раствора соляной кислоты и добавляют дистиллированную воду до объема 85 - 90 куб. см. При необходимости проводят подтитровку буферного раствора до значения рН 8,4 раствором трис-(оксиметил)-аминометана или кислоты и доводят общий объем до 100 куб. см дистиллированной водой.

Раствор хранят в холодильнике не более 10 суток.

9.1.7. Приготовление субстратной смеси

В строгой последовательности смешивают растворы пектина, трис-солянокислого буфера и хлористого кальция в соотношении 5:2:1.

Готовят непосредственно перед проведением анализа.

Смесь хранят при комнатной температуре не более 8 - 12 ч.

Подготовку спектрофотометра проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины оптической плотности от массы анализируемого вещества в пробе, взятой для анализа, устанавливают при помощи градуировочных растворов фитолиазы в соответствии с табл. 1.

Градуировочные растворы изготавливаются непосредственно перед измерениями. Хранить не более 6 ч в бытовом холодильнике.

Анализ производят следующим образом.

В каждую опытную пробирку наливают 8 куб. см субстратной смеси, прогревают в течение 5 мин. при 40 °С, после чего добавляют 2 куб. см градуировочного раствора, содержащего фитолиазу, перемешивают встряхиванием и инкубируют в течение 15 мин. строго по секундомеру при 40 °С. Затем отбирают 1 куб. см смеси и переносят в пробирку, содержащую 9 куб. см раствора соляной кислоты.

Одновременно с опытными пробами готовят холостую. Для этого в пробирку, содержащую 9 куб. см раствора соляной кислоты, добавляют 0,8 куб. см субстратной смеси и 0,2 куб. см дистиллированной воды.

Оптическую плотность опытного раствора измеряют против контрольного раствора на спектрофотометре в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 1 см при длине волны 235 нм.

Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности из 5 параллельных измерений.

По полученным значениям оптических плотностей строят градуировочный график, имеющий линейную зависимость оптической плотности от концентрации фитолиазы.

Рабочая зона оптической плотности лежит в области 0,1 - 0,6D.

Воздух с объемным расходом 20 куб. дм/мин. аспирируют в течение 20 мин. через фильтр АФА-ВП-10, помещенный в фильтродержатель. Для определения 1/2 ПДК фитолиазы следует отобрать 400 куб. дм воздуха.

Отобранные пробы хранятся в условиях сухого помещения в закрытом сосуде при комнатной температуре до 5 суток.

Фильтр с отобранной пробой переносят в стаканчик, приливают в него 5 куб. см дистиллированной воды, оставляют на 10 мин., периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Полученный раствор отливают в пробирку, а экстракцию продолжают добавив в стаканчик с фильтром 5 куб. см дистиллированной воды. Затем фильтр тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в одну пробирку. Таким образом получают 10 куб. см элюата фитолиазы.

Степень десорбции фитолиазы с фильтра составляет 96%.

Анализ 2 куб. см элюата на содержание фитолиазы проводят точно так же, как при построении градуировочного графика.

Оптическую плотность анализируемого раствора измеряют аналогично градуировочным растворам по сравнению с контрольным, который готовят одновременно и аналогично пробам, используя чистый фильтр.

По градуировочному графику находят количество фитолиазы в исследованных растворах.

Если значения оптических плотностей находятся за пределами рабочей зоны градуировочного графика, то опыт необходимо повторить с раствором, имеющим большее или меньшее содержание фитолиазы.

Концентрацию фитолиазы в воздухе (С, мг/куб. м) вычисляют по формуле:

где:

а - содержание фитолиазы, определенное в объеме пробы, взятом для анализа, мкг;

в - общий объем пробы, куб. см;

б - объем пробы, взятой для анализа, куб. см;

V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям, куб. дм (см. Прилож. 1).

Результат количественного анализа представляют в виде (С +/- С х ДЕЛЬТА / 100) мг/куб. м, Р = 0,95, где ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, выраженная в процентах.

Значения полученных метрологических характеристик погрешности, норматива оперативного контроля точности и норматива оперативного контроля воспроизводимости, выраженные в процентах, приведены в табл. 2.

При превышении расхождения между двумя результатами норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

Периодичность проведения внутреннего оперативного контроля воспроизводимости и интервал времени между первичным и повторным анализами пробы устанавливают с учетом стабильности условий выполнения контрольных измерений; периодичности и длительности проведения КХА, устанавливаемых соответствующими нормативными документами; вариации состава анализируемых проб; плана выборочного статистического контроля воспроизводимости (как правило, интервал времени между получением первичного и повторного результатов КХА пробы составляет 1 - 3 дня).

Внутренний оперативный контроль точности проводят для каждого интервала определяемых концентраций. Единичные контрольные измерения выполняют в одной серии с КХА рабочих проб за период, в течение которого условия проведения КХА допустимо считать постоянными. Число контрольных измерений зависит от установленных планов статистического контроля точности.

Образцами для оперативного контроля точности являются стандартные образцы с известным содержанием измеряемого вещества, величина которого должна быть близкой к анализируемым пробам.

При контроле качества результатов КХА состава воздушных сред при отсутствии в лаборатории промышленных смесей или невозможности их создания, в качестве образца для контроля используют стандартный образец, нанесенный на фильтр или другое устройство, на которое концентрируют исследуемые вещества. При этом, следует иметь в виду, что погрешность процедуры отбора проб контролируется путем поверки используемых пробоотборников, и расчет норматива контроля точности осуществляют, исходя из характеристики погрешности методики КХА за вычетом характеристики погрешности используемого пробоотборника и характеристики погрешности, связанной с неполным извлечением анализируемых компонентов.

Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении условия:

Для проведения серии анализов из 6 параллельных проб требуется 2,5 ч.

Методические указания разработаны Российским государственным медицинским университетом (А.В. Лиманцев).

Приведение объема воздуха к стандартным условиям (температура 20 °С и давление 101,33 кПа) проводят по формуле: