"МУК 4.1.2764-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение метрибузина в биологических средах экспериментальных животных (почках, печени, головном мозге, семенниках, моче, кале) методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 17.11.2010)

1. Методические указания разработаны ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора".

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

3. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций метрибузина в биологических средах экспериментальных животных в диапазонах 0,004 - 0,04 мг/кг (почки, печень, семенники, кал), 0,01 - 0,1 мг/кг (головной мозг) и 0,001 - 0,01 мг/куб. дм (моча).

Метрибузин

4-амино-6-трет-бутил-4,5-дигидро-3-метилтио-1,2,4-триазин-5-он (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Область применения

Метрибузин - избирательный системный гербицид класса 1,2,4-триазинона, ингибирует фотосинтез. В растения проникает через корни и листья.

Препараты на основе метрибузина могут представлять собой стандартные суспензии (с размером частиц более 2 мкм), а также наноформы, образующие водные системы с размером частиц менее 0,1 мкм.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с термоионным (ТИД) и электронозахватным (ЭЗД) детекторами после экстракции из анализируемых проб биологических сред ацетонитрилом, последовательной очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, окислением марганцовокислым калием в щелочной среде, затем на концентрирующих патронах Sep Pak Silica и С18 Sep Pak.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на газовом хроматографе.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/кв. см), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ 03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

К выполнению измерений допускают специалиста, имеющего квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе, освоившего данную методику и подтвердившего экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов Sep Pak Silica и С18 Sep Pak.

7.1.1. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.1.2. Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3. Хлористый метилен и этилацетат

Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%

Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в деионизованной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

Хлористый метилен (этилацетат) промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают (56 +/- 0,1) г гидроксида калия, растворяют в 250 - 300 куб. см деионизованной воды, доводят водой до метки, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают (0,5 +/- 0,01) г марганцовокислого калия, доводят водой до метки, перемешивают. Раствор хранят в темном месте.

В коническую колбу вместимостью 500 куб. см с притертой пробкой помещают 250 куб. см гексана, вносят (10 +/- 1) куб. см ацетонитрила, перемешивают в течение 5 мин. Хранят в темном месте.

7.5.1. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 7:3). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 70 куб. см гексана и 30 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.5.2. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 9:1). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 90 куб. см гексана и 10 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.5.3. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 80 куб. см гексана и 20 куб. см этилацетата, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 30 куб. см ацетонитрила и 70 куб. см деионизованной воды, перемешивают.

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума.

Концентрирующий патрон промывают с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, последовательно 3 куб. см метанола, 5 куб. см смеси гексан - этилацетат (7:3, по объему), 5 куб. см гексана со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в секунду. Патрон готовят непосредственно перед использованием. Нельзя допускать высыхания верхнего слоя сорбента.

Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, 5 куб. см метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в секунду, затем 10 куб. см деионизованной воды.

Патрон готовят непосредственно перед использованием.

7.9.1. Исходный раствор метрибузина для градуировки (массовая концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г метрибузина, растворяют в 50 - 70 куб. см этилацетата, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 2-х месяцев.

Градуировочные растворы N 2 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.9.2. Раствор N 1 метрибузина для градуировки (массовая концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора метрибузина с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.9.1), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более месяца.

7.9.3. Рабочие растворы N 2 - 5 метрибузина для градуировки и внесения (массовая концентрация 0,1 - 1,0 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10 куб. см раствора N 1 метрибузина с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.9.2), доводят до метки этилацетатом, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией метрибузина 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более месяца.

Эти растворы используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено".

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площадей пиков (мВ х с) от концентрации метрибузина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 2 - 5 (п. 7.9.3).

В испаритель хроматографа вводят 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.1 или 9.3.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Устанавливают площади пиков (в мВ х с) метрибузина.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значение площадей отличается более чем на 11% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

Пробы органов, тканей, кала и мочи отбирают в лабораторных условиях, герметично упаковывают в полипропиленовые или стеклянные емкости с притертыми крышками, замораживают и хранят в морозильной камере при температуре ниже -18 °С.

Непосредственно перед анализом образцы органов, тканей, а также кала тщательно измельчают с использованием гомогенизатора.

9.1.1. Печень, почки, семенники, головной мозг, кал

Образец печени, почек, семенников и кала массой 5 г, головного мозга массой 2 г гомогенизируют в сосуде для гомогенизации с порцией ацетонитрила объемом 5 - 7 куб. см. Гомогенизированный образец с порциями ацетонитрила по 10 - 15 куб. см переносят в коническую колбу вместимостью 100 - 150 куб. см (общий объем ацетонитрила с учетом растворителя, взятого для гомогенизации и обмыва сосуда для гомогенизации, - 70 куб. см), дополнительно тщательно перемешивают и помещают на 1 ч в холодильник (4 - 6 °С). Затем надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр, помещенный в конусную воронку, в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 30 куб. см ацетонитрила, предварительно ополоснув растворителем колбу, в которой находилась проба, объединяя фильтрат с основной порцией в делительной воронке. Затем в делительную воронку вносят 20 куб. см гексана, насыщенного ацетонитрилом, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, перенося в коническую колбу на 100 - 150 куб. см, верхнюю гексановую промывку отбрасывают. Ацетонитрильный раствор возвращают в делительную воронку и операцию промывки повторяют новой порцией гексана, насыщенного ацетонитрилом, объемом 20 куб. см. Верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный раствор переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см, вносят в нее 10 куб. см деионизованной воды, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 35 - 40 °С до объема около 20 куб. см, внимательно следя за процессом, не допуская переброса жидкости при вспенивании, и очищают по п. 9.2.

9.1.2. Моча

Пробу мочи объемом 20 куб. см помещают в коническую колбу вместимостью 100 - 150 куб. см, вносят 50 куб. см ацетонитрила, перемешивают и помещают на 1 час в холодильник (4 - 6 °С). Затем раствор осторожно переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, после полного расслаивания нижний водный слой отделяют и отбрасывают. В делительную воронку вносят 10 куб. см гексана, насыщенного ацетонитрилом, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, перенося в коническую колбу на 100 - 150 куб. см, верхнюю гексановую промывку отбрасывают. Ацетонитрильный раствор возвращают в делительную воронку и операцию промывки повторяют новой порцией гексана, насыщенного ацетонитрилом, объемом 10 куб. см. Верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный раствор переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см, вносят в нее 10 куб. см деионизованной воды, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 35 - 40 °С до объема около 20 куб. см и очищают по п. 9.2.

9.2.1. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и окислением

Остаток в колбе, полученный по п. 9.1.1 или 9.1.2, с помощью 80 куб. см деионизованной воды переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, колбу дополнительно обмывают 20 куб. см воды, которую также переносят в воронку. Вносят в воронку 10 куб. см насыщенного раствора натрия хлористого, перемешивают и помещают на 1 час в холодильник или на 15 мин. в морозильную камеру. Затем в воронку вносят 2 куб. см 2 М раствора калия гидроксида и 50 куб. см дихлорметана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в новую делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Экстракцию метрибузина повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 20 куб. см. Для полного разделения фаз содержимое воронки должно отстояться 10 - 15 мин. Следы дихлорметана в водной фазе недопустимы, поскольку это снижает полноту извлечения вещества.

В делительную воронку, содержащую объединенные дихлорметановые экстракты, вносят 10 куб. см 2 М раствора калия гидроксида и 5 куб. см 0,1%-ного раствора марганцовокислого калия (при анализе печени объем раствора марганцовокислого калия увеличивают до 6 куб. см), интенсивно встряхивают в течение 3-х мин. Для полного разделения фаз содержимое воронки должно отстояться 10 - 15 мин. Следы дихлорметана в водной фазе недопустимы, поскольку это снижает полноту извлечения вещества. После полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 куб. см, фильтруя через слой (около 1 см) безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусную воронку диаметром 56 мм. Сульфат натрия на фильтре промывают дополнительной порцией дихлорметана объемом 10 куб. см. Верхний водный слой отбрасывают.

Объединенные экстракт и промывку, пропущенные через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °С. Дальнейшую очистку на концентрирующем патроне Sep Pak Silica проводят по п. 9.2.2.

9.2.2. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Sep Pak Silica

Остаток в колбе, полученный после упаривания по п. 9.2.1, растворяют в 5 куб. см гексана, помещая на 30 - 40 с на ультразвуковую баню, и вносят с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон Sep Pak Silica (подготовленный по п. 7.7) со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в секунду. Колбу ополаскивают 5 куб. см гексана, который также наносят на патрон. После нанесения пробы патрон промывают 3 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1, по объему), элюат отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 10 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему), собирая элюат в круглодонную колбу, упаривают при температуре не выше 35 °С досуха. Остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, вносят 9 куб. см деионизованной воды, помещают на ультразвуковую баню на 45 - 60 с. Дальнейшую очистку на концентрирующем патроне С18 Sep Pak проводят по п. 9.2.3.

9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующем патроне С18 Sep Pak

Раствор в колбе, полученный по п. 9.2.2, вносят с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон С18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.8, со скоростью пропускания раствора 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Патрон дополнительно промывают (скорость 2 капли в секунду) 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 3:7 (по объему), также собирая элюат в круглодонную колбу. Объединенный элюат упаривают досуха при температуре не выше 40 °С, для полного удаления следов влаги вносят в колбу порцию ацетонитрила (5 - 7 куб. см) и вновь упаривают.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см этилацетата и анализируют содержание метрибузина по п. п. 9.3.1 или 9.3.2.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

9.3.1. Хроматограф газовый, снабженный термоионным детектором.

Колонка капиллярная DB-5ms длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 100 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 220 °С, выдержка 5 мин., нагрев колонки со скоростью 25 градусов в минуту до температуры 270 °С (выдержка 2 мин.).

Скорость воздуха 200 куб. см/мин.; водорода 10,5 куб. см/мин.; газа 3 (азот) 30 куб. см/мин.

Скорость газа 1 (азот): 35,544 см/с, давление 120 кПа, поток 1,393 куб. см/мин., деление потока 1:5.

Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.

Ориентировочное время удерживания метрибузина: ~ 12,5 мин.

9.3.2. Газовый хроматограф, снабженный электронозахватным детектором.

Колонка капиллярная DB-1701 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 80 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 230 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 20 градусов в минуту до температуры 270 °С (выдержка 1 мин.).

Скорость газа 1 (азот): 35,971 куб. см/с, давление 70 кПа, поток 2,015 куб. см/мин.

Деление потока 1:2,9.

Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.

Ориентировочное время выхода метрибузина: ~ 16,9 мин.

Линейный диапазон детектирования: 0,01 - 0,1 нг.

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков вещества (в мВ х с), находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию метрибузина в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с массовой концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют этилацетатом не более чем в 50 раз. При расчете содержания метрибузина учитывают разбавление.

Содержание метрибузина в пробе (X, мг/кг, мг/куб. дм) рассчитывают по формуле:

где:

C - концентрация метрибузина, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса (объем) анализируемого образца, г (куб. см).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание метрибузина в пробе печени, почек, семенников, кала менее 0,004 мг/кг; головного мозга - менее 0,01 мг/кг; мочи - менее 0,001 мг/куб. дм" <*>.

--------------------------------

<*> 0,004 мг/кг - предел обнаружения в печени, почках, семенниках, кале; 0,01 мг/кг - головном мозге; 0,001 мг/куб. дм - моче.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора.